石卓林，楊曉花，袁曉梅

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)，河南 衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性、進行性呼吸系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)以呼吸困難、肺功能逐漸惡化，病理變化以肺泡上皮細胞損傷、成纖維細胞過度增殖、肺泡結(jié)構(gòu)破壞為主要特征[1-2]。IPF的發(fā)病機制目前尚不明確，臨床尚無理想的治療手段，患者預(yù)后較差，多進展為呼吸衰竭[3]。對IPF發(fā)病機制的深入研究，有望實現(xiàn)早期干預(yù)，進而改善臨床治療效果。

外泌體是一類直徑80～100 nm的磷脂膜包被囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、RNA等多種物質(zhì)，廣泛存在于機體血液、唾液、尿液、腦脊液、羊水等體液中[4]。外泌體microRNAs表達譜受到外界環(huán)境刺激、疾病狀態(tài)不同產(chǎn)生相應(yīng)變化，外泌體microRNA被認為是細胞間信息傳遞的“信使”，參與機體功能調(diào)控。外泌體microRNA在腫瘤、代謝性疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等發(fā)生發(fā)展中起到了明確的作用[5-7]。本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)，對比了健康人群與IPF患者血清外泌體microRNA表達譜的差異，旨在探討IPF發(fā)生的可能機制及IPF干預(yù)的新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年1月至2021年1月就診于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科的24例初診IPF患者作為IPF組，其中男13例，女11例；年齡47～69(59.79±5.99)歲，有吸煙史者9例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2016年《特發(fā)性肺纖維化診斷和治療中國專家共識》中IPF診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；(2)首次確診的IPF患者；(3)年齡18～70歲；(4)臨床資料完整。另選擇同期健康體檢者24名為對照組，其中男10例，女14例；年齡47～70(57.83±6.72)歲，有吸煙史者5例。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往體健，入組時未合并臨床明確診斷的急慢性疾病；(2)年齡18～70歲；(3)臨床資料完整。IPF組及對照組均排除患有嚴重心臟疾病、感染、肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、腫瘤等疾病者。2組研究對象性別、年齡、吸煙史比例比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象簽署知情同意書，本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 2組受試者肺功能相關(guān)指標(biāo)檢測分別于IPF患者入院后第2天、對照組受試者體檢日使用肺功能檢測儀器(德國Cortex Matamax 3B)進行肺功能相關(guān)指標(biāo)檢測。受試者戴上呼吸面罩后，先用嘴巴正常呼吸 3～5次，待測試界面中呼吸曲線趨于穩(wěn)定后，受試者深吸一口氣，然后快速吐氣，吐氣時間根據(jù)設(shè)備界面提示，連續(xù)2次滿足要求即為完成，記錄受試者肺總量 (total lung capacity，TLC)、第1 秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比(forced expiratory volume in one second/predict value，F(xiàn)EV1% pred) 、一氧化碳彌散量占預(yù)計值百分比(carbon mon-oxide diffusing capacity /predict value，DLCO%pred)。

1.2.2 血清外泌體分離提取及鑒定于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集2組受試者靜脈血15 mL，于4 ℃下3 000×g離心10 min，分離血清；將上清液移入50 mL 離心管，放入高速離心機中，12 000×g離心45 min 去除細胞碎片及細胞器成分；取上清液，再次放入高速離心機，110 000×g離心2 h，棄上清保留沉淀物；用 l mL 磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)將沉淀物重懸，經(jīng)0.22 μm無菌濾器過濾后移入50 mL離心管中； 110 000×g再次離心70 min，棄上清，得到的沉淀即為提純后的外泌體。用200 μL PBS將沉淀重懸后置于-80 ℃冰箱保存。使用透射電鏡鑒定分離出的外泌體形態(tài)。

1.2.3 外泌體microRNA的提取及cDNA文庫構(gòu)建采用TRIzol法提取外泌體總RNA。提取出的總RNA使用銳博公司microRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA文庫。

1.2.4 microRNA測序及生物信息學(xué)分析構(gòu)建好的cDNA文庫由廣州銳博生物公司使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 和 ABI StepOnePlus RT-PCR 系統(tǒng)進行質(zhì)控。通過質(zhì)控后的樣本借助公司Illumina HiSeqTM2500高通量測序平臺進行測序。應(yīng)用Target Scan 7.0、miRDB及 miRanda軟件預(yù)測靶基因，對靶基因進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路注釋。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者肺功能相關(guān)指標(biāo)比較結(jié)果見表1。IPF組患者的TLC、FEV1% pred、DLCO%pred均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組受試者肺功能相關(guān)指標(biāo)比較

2.2 2組受試者血清外泌體microRNA表達譜比較透射電鏡下可見外泌體為直徑100 nm左右的囊泡(圖1)。2組受試者間共有168種差異表達的microRNA。與對照組比較，IPF組有64種microRNA表達上調(diào)，104種microRNA表達下調(diào)(圖2)。

圖1 外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)(透射電鏡，×20 000)

圖2 2組受試者外泌體中microRNA的表達

2組受試者血清外泌體中microRNA按表達量由高到低排序，對照組中表達量最高的前5種microRNA分別為miR-1-3p、miR-148a-3p、miR-99a-5p、miR-126a-3p和miR-1b，分別涉及磷脂酰肌醇激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路(phosphatidylinositol-3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin signaling pathway，PI3K/Akt/mTOR)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases，MAPK)信號通路、mTOR信號通路及檸檬酸循環(huán)。IPF組中表達量最高的前5種microRNA分別為miR-148a-3p、miR-206-3p、miR-126a-3p、miR-3596a和let-7a-5p，分別涉及MAPK信號通路、醚類脂質(zhì)代謝、檸檬酸循環(huán)、環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信號通路以及Notch 信號通路。與對照組相比，IPF組中有3種microRNA(miR-1-3p、miR-99a-5p、miR-1b)的表達量發(fā)生了變化，該3種microRNA涉及PI3K/Akt/mTOR信號通路。IPF組患者血清外泌體中miR-1-3p、miR-99a-5p的表達顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[log2(fold change)分別為-3.98和-3.78，P<0.05]；2組間miR-1b表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[log2(fold change)=1.36，P>0.05]。

將2組受試者血清外泌體中microRNA按照表達差異倍數(shù)由高到低排序，差異最大的前5種microRNA分別為miR-672-5p(涉及腫瘤壞死因子信號通路)、miR-466b-3p(涉及炎癥介質(zhì)對瞬時受體電位的調(diào)控)、miR-204-5p(涉及磷脂酰肌醇信號系統(tǒng))、miR-215(涉及核黃素代謝)、miR-411-5p(涉及PI3K/Akt/mTOR信號通路)。

2組受試者血清外泌體中microRNA的表達模式相近，反映出樣本質(zhì)控良好(圖3)。

圖3 2組受試者外泌體microRNA熱圖

2.3 差異表達的microRNA與IPF患者肺功能的關(guān)系結(jié)果見圖4。將按表達量由高到低排序篩選出的2種差異表達且涉及PI3K/Akt/mTOR信號通路的microRNA(miR-1-3p、miR-99a-5p)和按照表達差異倍數(shù)由高到低篩選出的1種差異表達且涉及PI3K/Akt/mTOR信號通路的microRNA(miR-411-5p)與IPF患者肺功能指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，miR-1-3p、miR-99a-5p、miR-411-5p與IPF患者 DLCO%pred呈正相關(guān)(r=0.575、0.617、0.825，P<0.05)；3種microRNAs與IPF患者的TLC、FEV1% pred無相關(guān)性(rTCL=0.324、0.24、0.396,rFEV1%pred=0.411、0.389、0.474;P>0.05)。

圖4 血清外泌體miR-1-3p、miR-99a-5p、miR-411-5p與IPF患者DLCO%pred的相關(guān)性

3 討論

IPF以肺組織成纖維細胞異常增殖、細胞外基質(zhì)沉積及炎癥細胞浸潤為特點，最終引起肺功能進行性下降，目前尚無理想的治療藥物，確診患者的平均生存周期僅3 ～ 5 a，針對IPF發(fā)病機制及新治療藥物的探索一直是呼吸系統(tǒng)疾病研究領(lǐng)域的熱點[2,9]。

近年來，外泌體在細胞間信息傳遞中的作用得到了廣泛的證實，其中關(guān)于外泌體microRNA的作用研究最為成熟。供體細胞受機體疾病狀態(tài)影響，產(chǎn)生的外泌體microRNA表達譜發(fā)生變化，被下游的接收細胞攝取后作用于microRNA的靶基因，調(diào)節(jié)下游細胞的生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體microRNA參與了代謝性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程。外泌體microRNA在組織纖維化發(fā)展中起到了重要作用。WANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-425及miR-744參與了心肌纖維化的發(fā)展，且其表達量的下降程度與心力衰竭進展密切相關(guān)。LV 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-29c 和miR-21的表達異?？赡軈⑴c了腎臟纖維化，并且miR-29c和miR-21的表達量可用于預(yù)測腎臟纖維化程度。此外，還有研究表明，外泌體microRNA參與了腹膜及肝臟的纖維化[12-13]。

還有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體microRNA有望成為纖維化病變的診斷標(biāo)志物，可為疾病的分期、預(yù)后判斷提供新的手段[14-15]。MAKIGUCHI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-21-5p水平與IPF患者肺功能密切相關(guān)，高水平的miR-21-5p是IPF患者肺功能快速下降、高病死率的預(yù)測指標(biāo)。GUIOT 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，IPF患者唾液外泌體miR-142-3p的表達量與肺功能呈負相關(guān)，異常表達的microRNA可通過Wnt信號通路促進間充質(zhì)干細胞異常增殖，促進肺組織纖維化。本研究發(fā)現(xiàn)，IPF組患者血清外泌體microRNA表達譜與對照組比較有差異，2組受試者外泌體microRNA種類及含量不同。對照組受試者血清外泌體中microRNA豐度最高的前5種microRNA中，包含3種與PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)的microRNA(miR-1-3p、miR-99a-5p、miR-1b)，而這些microRNA在IPF組中表達下降。此外，比較2組受試者表達差異倍數(shù)最為明顯的5種microRNA，涉及PI3K/Akt/mTOR信號通路的miR-411-5p在IPF組中表達顯著降低。這提示，與對照組比較，涉及PI3K/Akt/mTOR信號通路的microRNA表達量在IPF患者中顯著降低。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，mTOR可將其下游蛋白磷酸化，參與調(diào)控蛋白質(zhì)及脂類合成、細胞生長、細胞自噬等過程。mTOR 信號通路的上游受多種信號通路調(diào)控，其中PI3K/Akt/mTOR 信號通路是調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和存活的核心信號通路。異常的PI3K/Akt/mTOR信號通路參與心肌、腎臟及肝臟等多種臟器和組織的纖維化過程[17-19]。動物實驗表明，活化的PI3K/Akt/mTOR信號通路可促進成纖維細胞增殖及纖維化進程，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可促進成纖維細胞凋亡，減少細胞外基質(zhì)沉積，延緩肺組織纖維化[20-21]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號通路是參與細胞自噬的重要通路，激活PI3K/Akt/mTOR信號通路可抑制自噬發(fā)生[22]。肺泡上皮損傷導(dǎo)致的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與IPF的發(fā)生密切相關(guān)，而自噬活性下降是導(dǎo)致EMT發(fā)生的重要分子機制[23-24]。由此推測，活化的PI3K/Akt/mTOR信號通路參與了IPF的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-1-3p、miR-99a-5p、miR-411-5p表達量與患者肺功能呈正相關(guān)性，miR-1-3p、miR-99a-5p、miR-411-5p表達量越低，患者肺功能越差。microRNA的經(jīng)典作用機制為通過與信使RNA 3′端非翻譯區(qū)的microRNA調(diào)控元件結(jié)合，導(dǎo)致信使RNA降解，起到負向調(diào)控靶基因表達的作用。因此推測，IPF患者血清中外泌體microRNA表達量降低可能使得PI3K/Akt/mTOR信號通路被異?；罨瑥亩鴧⑴cIPF的發(fā)生。

目前外泌體的治療作用已在多個領(lǐng)域內(nèi)得到證實，干細胞或正常個體來源的外泌體可通過傳遞功能性microRNA在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、慢性炎癥等疾病領(lǐng)域發(fā)揮治療作用。本研究的不足為僅對3種差異表達的外泌體microRNA表達趨勢與IPF患者肺功能進行了相關(guān)分析。3種差異表達的microRNA在IPF發(fā)生、發(fā)展中的確切作用以及外泌體microRNA對IPF的治療作用還有待進一步的體內(nèi)外實驗驗證。