李 蓉，宋宗良，張效科，武寧靜，游清嘯

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西 咸陽 712000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病導(dǎo)致的慢性腎臟損傷，臨床上以血糖升高、蛋白尿、腎小球?yàn)V過率下降為特征，引起的病理改變包括腎小球基底膜增厚、足突融合、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等[1]。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，高血糖、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、氧化應(yīng)激、病毒感染、炎癥因子、遺傳突變、凋亡自噬等均可導(dǎo)致其發(fā)生，其中ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在DN病程進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。ERS是機(jī)體面對(duì)多種刺激因素和損傷因子進(jìn)行適應(yīng)環(huán)境的自我調(diào)整，適度的ERS有益于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的修復(fù)與穩(wěn)定，是機(jī)體正常運(yùn)行的重要條件。但持久且過度的ERS會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)，對(duì)組織器官造成實(shí)質(zhì)性損害。越來越多研究表明，ERS、細(xì)胞凋亡與DN的病程發(fā)展密切相關(guān)，其中蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT enhance-binding protein homologous protein,CHOP)/門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(cysteine-containing aspartate-specific proteases-12,caspase-12)信號(hào)通路是ERS誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡的重要途徑，通過抑制該通路可以保護(hù)腎臟，延緩DN的發(fā)病進(jìn)程。本文就ERS、細(xì)胞凋亡及PERK/CHOP/caspase-12信號(hào)通路在DN發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用進(jìn)行綜述。

1 ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與DN

1.1 細(xì)胞凋亡在DN疾病進(jìn)展中的作用細(xì)胞凋亡在DN、阿爾茨海默病、癌癥等疾病的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，生理狀態(tài)下凋亡具有維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定作用，在各種病理因素刺激后誘發(fā)凋亡因子，誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致DN等疾病的發(fā)展[2]。凋亡是高等真核生物中一種主動(dòng)程序性細(xì)胞死亡的過程，是通過體積減少、細(xì)胞表面起泡、染色質(zhì)DNA的縮合、核小體間裂解和凋亡小體的形成最終完成的，是對(duì)應(yīng)激環(huán)境的一種應(yīng)答反應(yīng)[3]。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖相互作用制衡，共同調(diào)控機(jī)體組織發(fā)展的進(jìn)程[4]。研究發(fā)現(xiàn)，caspase是細(xì)胞凋亡的主要分子，其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑可分為線粒體途徑、死亡受體途徑、顆粒酶B途徑，而現(xiàn)新發(fā)現(xiàn)的ERS介導(dǎo)的凋亡途徑在大多數(shù)應(yīng)激的真核細(xì)胞內(nèi)都存在，并在DN、心血管疾病、腫瘤等疾病的病程中發(fā)揮作用[5]。隨著對(duì)分子生物學(xué)認(rèn)識(shí)的逐漸深入，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為ERS及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是引起DN發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制之一[6]。在DN的病程進(jìn)展中，血糖升高、蛋白尿、炎癥等持續(xù)應(yīng)激可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，出現(xiàn)ERS，其通過刺激細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)(如PERK/CHOP信號(hào)通路)增加促凋亡分子的表達(dá)，活化caspase分子，最終誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡，引起腎臟病理學(xué)改變，腎功能下降[7]。魏靜等[8]研究發(fā)現(xiàn)，DN小鼠腎小球?yàn)V過率降低的關(guān)鍵原因是ERS介導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡。因此，研究導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡的刺激因素、通路等是非常有必要的。

1.2 ERS在DN病程中的作用腎臟的各種類型細(xì)胞普遍具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)，DN患者在血糖升高或波動(dòng)過大以及出現(xiàn)大量蛋白尿時(shí)易觸發(fā)ERS，當(dāng)機(jī)體處于過度ERS時(shí)會(huì)導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡、損壞腎臟結(jié)構(gòu)，進(jìn)而加速DN的進(jìn)程，從而形成惡性循環(huán)[9]。ERS是指由于錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)大量堆積，細(xì)胞為維持其正常功能而觸發(fā)的一系列效應(yīng)。未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction,UPR)信號(hào)通路作為ERS的主要通路，是目前的研究熱點(diǎn)，UPR信號(hào)通路由PERK、肌醇需求酶 1(inositol requiring enzyme l,IRE1)-α、激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感受蛋白所介導(dǎo)[10-11]。其中PERK的功能主要是降低細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新合成的蛋白質(zhì)，IRE-l、ATF6的主要功能是增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中伴侶基因表達(dá)，下調(diào)大量錯(cuò)誤蛋白的折疊和降解，提高蛋白折疊能力；UPR通過上調(diào)伴侶基因分子的表達(dá)、清除相關(guān)蛋白質(zhì)、阻斷蛋白質(zhì)合成等綜合作用維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[12]。但隨著ERS持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度的增加，UPR的作用從維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)從而保護(hù)細(xì)胞轉(zhuǎn)變到促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，適度的應(yīng)激能夠促使UPR上調(diào)抗凋亡分子的表達(dá)和抑制蛋白合成，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能，開啟細(xì)胞保護(hù)機(jī)制；但持續(xù)強(qiáng)刺激則引起UPR起到相反作用，上調(diào)凋亡分子的表達(dá)，使得腎臟細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致DN的發(fā)生和進(jìn)展[14]。研究表明，敲除ERS的關(guān)鍵基因TRB3會(huì)加重DN患者的蛋白尿[15]。在DN中，ERS可通過調(diào)控活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成來減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而保護(hù)腎臟。

ERS主要通過以下機(jī)制在DN病程進(jìn)展中發(fā)揮作用:(1)干預(yù)細(xì)胞凋亡。DN病情加重的原因之一是過度ERS介導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡可損傷腎臟結(jié)構(gòu)及功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，血糖升高觸發(fā)的ERS經(jīng)過CHOP信號(hào)通路傳導(dǎo)促使大量腎臟細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致DN發(fā)生[16]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，ERS可以上調(diào)抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤蛋白2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達(dá)，抑制腎臟細(xì)胞過度凋亡，從而發(fā)揮維持腎臟正常功能的作用[17]。(2)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激。大量的ROS自由基為ERS及UPR的激活而堆積在細(xì)胞中，觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng),引發(fā)炎癥，激活PERK/CHOP/caspase-12等多種信號(hào)通路，成為DN的發(fā)病基礎(chǔ)。CAO等[18]研究證實(shí)，使用ERS抑制劑可減少足細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，從而減輕腎臟損傷，保護(hù)腎臟功能。(3)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。未折疊蛋白和晚期糖基化產(chǎn)物及其受體的大量累積可介導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致ERS，從而引發(fā)腎臟炎癥，提示DN中ERS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致其病情進(jìn)展的因素之一。CHOP是ERS細(xì)胞抗炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，有研究顯示，小鼠CHOP基因敲除后，腎臟炎癥反應(yīng)加重[19]，提示ERS可通過CHOP通路發(fā)揮抗炎作用，保護(hù)腎臟，證實(shí)了ERS可以調(diào)節(jié)DN腎臟炎癥反應(yīng)。(4)調(diào)節(jié)自噬。ERS通過UPR通路介導(dǎo)的PERK、ATF6、IRE1-α蛋白或Ca2+釋放濃度等調(diào)節(jié)自噬[20]。研究發(fā)現(xiàn)，在DN小鼠出現(xiàn)持續(xù)ERS時(shí)，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和ATG5基因表達(dá)降低，同時(shí)PERK的下游轉(zhuǎn)錄因子CHOP 的表達(dá)上調(diào)，腎臟損傷加重，提示DN病程中高強(qiáng)度的ERS會(huì)抑制自噬，從而導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡[21]。

以上研究表明，在DN病程中ERS的激活是一把雙刃劍，在ERS初期可以通過處理錯(cuò)誤或未折疊的蛋白質(zhì)維持腎臟的正常功能；但在高血糖、炎癥等各種因素長(zhǎng)時(shí)間的刺激下，ERS增強(qiáng)，UPR被過度激活，腎臟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能被破壞，引發(fā)細(xì)胞凋亡程序，當(dāng)細(xì)胞大面積發(fā)生凋亡，細(xì)胞數(shù)量急劇下降，就會(huì)出現(xiàn)該器官功能減退。綜上所述，ERS不僅是細(xì)胞自我保護(hù)，抵抗外界刺激的主要手段，還是在持續(xù)刺激下致使機(jī)體細(xì)胞損傷、凋亡的機(jī)制之一。因此，探究如何把握ERS在DN病程進(jìn)展中是發(fā)揮保護(hù)功能還是促凋亡功能顯得尤為重要。

2 PERK和CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與DN

隨著人們對(duì)DN分子體系認(rèn)識(shí)的深入探索，許多促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子開始作為治療DN的新方向。其中，ERS中PERK/CHOP/caspase-12信號(hào)通路誘發(fā)的凋亡被認(rèn)為是DN病程進(jìn)展的關(guān)鍵。由于ERS具有雙重功能，UPR作為ERS的主要通路，能夠通過PERK、IRE-1和ATF6來影響細(xì)胞中蛋白質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯，以減輕ERS。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持穩(wěn)態(tài)時(shí)，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78 (glucose regulated protein 78,GRP78)/免疫球蛋白結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,BIP)與PERK、IRE-1、ATF6蛋白分別結(jié)合，為失活狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生ERS時(shí)，這3種蛋白與GRP78/BIP解離，成為激活狀態(tài)，并分別誘導(dǎo)下游信號(hào)的傳導(dǎo)和基因的表達(dá)。因此，在高血糖等各種因素的不斷刺激下，腎臟細(xì)胞出現(xiàn)持續(xù)ERS時(shí)，下游CHOP、caspase-12等促凋亡轉(zhuǎn)錄因子被誘導(dǎo)活化，細(xì)胞開啟凋亡程序，腎臟結(jié)構(gòu)遭到破壞[22]。

PERK產(chǎn)生的調(diào)節(jié)效應(yīng)是UPR中最早也是最重要的一部分，是通過介導(dǎo)一系列基因的表達(dá)，在源頭上抑制錯(cuò)誤蛋白質(zhì)的合成，在應(yīng)激初期提高機(jī)體對(duì)抗ERS所形成的損害。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞中存在較多未折疊的蛋白時(shí)，與PERK結(jié)合的GRP78自動(dòng)與其分離，轉(zhuǎn)而與未折疊蛋白相結(jié)合，PERK則被激活，通過磷酸化真核細(xì)胞起始因子2α(eukaryotic initiationfactor 2α,eIF2α)抑制蛋白質(zhì)合成，并阻止新合成的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷加載，這種抑制作用對(duì)于維持細(xì)胞存活和代謝穩(wěn)態(tài)非常關(guān)鍵[23]。由此可見，ERS早期可通過降低蛋白質(zhì)的合成能力，減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的合成，提高細(xì)胞應(yīng)對(duì)環(huán)境中刺激因素的能力，維持細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)，從而抑制DN的發(fā)生和發(fā)展。磷酸化的eIF2α也會(huì)增加激活轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)的翻譯，ATF4的增加能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子CHOP的表達(dá)，如果此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未被修復(fù)，仍然處于過度應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，PERK/ATF4/CHOP通路被激活，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[24]。HUANG等[25]在DN發(fā)病機(jī)制研究中的結(jié)果與上述研究一致。由此可知，過度持續(xù)的ERS使得UPR的自我適應(yīng)能力下降，導(dǎo)致細(xì)胞不可逆受損，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26]。過多細(xì)胞的損傷、凋亡可引起腎臟結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害，包括腎小球硬化、腎小球?yàn)V過功能下降、尿蛋白增多等，從而加劇DN病程的進(jìn)展。PERK的激活和eIF2α的磷酸化被認(rèn)為是ERS激活的標(biāo)志。

CHOP是ERS的促凋亡蛋白之一，其在正常情況下一般呈低表達(dá)，但ERS激活后PERK可顯著上調(diào)前凋亡基因 CHOP 的轉(zhuǎn)錄[27]。CHOP可下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，并上調(diào)促凋亡蛋白相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax) 的表達(dá)，進(jìn)而活化caspase家族蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[28]。陳玉鳳等[29]研究發(fā)現(xiàn)，增加DN小鼠腎臟中PERK、GRP78的表達(dá)可激活CHOP基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)改變，而在敲除CHOP基因后，腎臟之前發(fā)生的改變較前好轉(zhuǎn)，減慢了腎臟病變進(jìn)程，表明了CHOP誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡是DN病程進(jìn)展的關(guān)鍵。也有研究發(fā)現(xiàn)，低血糖、高血糖，特別是血糖波動(dòng)誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)的PERK/CHOP 通路激活，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過度死亡，加快DN的進(jìn)程[30]。提示CHOP是機(jī)體由早期抵抗細(xì)胞凋亡到促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵信號(hào)蛋白，能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程，因此，阻斷CHOP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)ERS誘導(dǎo)的DN，將是DN治療的潛在靶點(diǎn)之一[31]。

綜上可知，導(dǎo)致DN進(jìn)展的關(guān)鍵因素是腎臟細(xì)胞發(fā)生ERS后，PERK的激活和CHOP的持續(xù)高表達(dá)，使得Bax持續(xù)作用，從而促進(jìn)腎臟細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3 caspase-12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與DN

Caspase家族蛋白同源性較高，結(jié)構(gòu)相似，均具有N-端的半胱氨酸激活位點(diǎn)及底物裂解位點(diǎn)。目前已知曉的caspase系列蛋白酶有14種，根據(jù)其在凋亡調(diào)節(jié)中作用的不同分為炎癥介導(dǎo)因子(如caspase-1、caspase-4、caspase-5、caspase-11、caspase-12、caspase-13、caspase-14)、凋亡啟動(dòng)因子(如caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10)和凋亡執(zhí)行因子(如caspase-3、caspase-6、caspase-7)。

其中caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上的蛋白質(zhì)之一，其在膜受體和通路中不能被啟動(dòng)，是ERS特殊的凋亡通路，作為DN病程中導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白通過活化 caspase-9和 caspase-3介導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡，并且能夠?qū)RS相關(guān)凋亡產(chǎn)生促進(jìn)作用。而腎臟細(xì)胞的凋亡是致使DN發(fā)生、發(fā)展的主要原因。caspase-3作為細(xì)胞凋亡過程中的主要凋亡執(zhí)行因子，其活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的一個(gè)重要特征[32]。研究發(fā)現(xiàn)，CHOP與caspase-12之間具有關(guān)聯(lián)性，CHOP 蛋白過表達(dá)可促進(jìn)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，釋放活性caspase-12，最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[33]。GUO等[34]研究發(fā)現(xiàn)，不對(duì)稱性二甲基精氨酸能夠激活腎臟細(xì)胞的PERK 和IRE1α途徑，誘導(dǎo)CHOP的表達(dá),從而激活下游的促凋亡信號(hào)途徑，使得Bax作用加強(qiáng)，Bcl-2作用減弱，誘導(dǎo)caspase-12的活化，從而促進(jìn)腎臟細(xì)胞凋亡，加快DN病程進(jìn)展。caspase-12作為在ERS介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白，直接誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞發(fā)生凋亡，加重DN進(jìn)程。綜上可知，PERK、CHOP、caspase-12三者之間構(gòu)成了上下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，DN患者在高糖等各種刺激下，腎臟組織被過度激活ERS，隨后PERK開始發(fā)揮作用，并且增加CHOP表達(dá)，而CHOP又可調(diào)控caspase-12的活化，從而介導(dǎo)腎臟細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致DN的進(jìn)展?？筛鶕?jù)DN發(fā)病機(jī)制中ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)，采用相應(yīng)的干預(yù)方法緩解過度的ERS，抑制其凋亡途徑，將會(huì)有效地遏制DN的發(fā)生和發(fā)展。

4 結(jié)語

在DN病程中，嚴(yán)重及長(zhǎng)期的ERS可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡，是引起腎臟損傷的關(guān)鍵，其中PERK/CHOP/caspase-12信號(hào)通路是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要通路。因此，可通過阻斷該通路，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎臟功能，延緩DN的進(jìn)展。但目前對(duì)ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑未完全明確，需要繼續(xù)深入研究，以期為臨床從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑防治 DN 的治療研究提供參考與理論支持。