樊曉慧，汪 洋，楊園園，張玉紅

（省部共建生物催化與酶工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,武漢 430062）

刺激響應(yīng)型納米載體通常具有增強(qiáng)藥物滲透性、延長循環(huán)時(shí)間和降低藥物不良毒性等特點(diǎn)［1，2］，在藥物遞送和控釋領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注［3，4］.但大多數(shù)載體不具備特異性識別能力，不能精準(zhǔn)地將藥物遞送到病灶部位，而且由于單一化療載體載藥能力的限制，大大制約了其治療效果［5，6］.有機(jī)-無機(jī)核殼結(jié)構(gòu)納米載體是一類以無機(jī)納米粒子為核、有機(jī)大分子為殼的核殼結(jié)構(gòu)納米載體，其能夠提供較大的藥物裝載效率、多樣化的表面修飾以及多樣化的治療手段，進(jìn)一步提升了藥物利用率和癌癥治療效果［7～9］.

貴金屬納米粒子化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有獨(dú)特光學(xué)特性，被廣泛用于癌癥治療、生物成像、化學(xué)傳感和藥物輸送等領(lǐng)域［10～13］.其中，金納米籠（AuNC）具有近紅外響應(yīng)的光熱轉(zhuǎn)換性能、獨(dú)特的中空多孔結(jié)構(gòu)以及生物相容性，被廣泛用作藥物控制釋放和光熱治療的藥物納米載體［14，15］.AuNC作為抗癌藥物的容器和光熱劑，可以結(jié)合光熱療法與化療，為腫瘤的治療提供更有效的方法.

透明質(zhì)酸（HA）是一種天然多糖，具有優(yōu)異的生理活性和生物相容性［16，17］；高表達(dá)的CD44載體蛋白的腫瘤細(xì)胞［如人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系（A549）和小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞（CT-26）等］具有較高的親和性，HA修飾后的納米材料也被賦予了一定的靶向性［18］.Li等［19］使用HA和異硫氰酸熒光素修飾Fe3O4納米粒子用于體內(nèi)靶向腫瘤磁共振，其中HA靶向的Fe3O4納米粒子可以被過量表達(dá)的CD44受體的癌細(xì)胞特異性攝取，并可用作體外靶向癌細(xì)胞的MR成像和體內(nèi)異種移植腫瘤模型的有效探針.此外，HA在透明質(zhì)酸酶（Haase）作用下能夠發(fā)生水解，當(dāng)HA改性納米粒子作為納米藥物載體進(jìn)入細(xì)胞后，在HAase作用下其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化從而釋放藥物，具有酶刺激響應(yīng)性［20］.酶刺激響應(yīng)性納米載體由于具有反應(yīng)條件溫和、高效性和專一性的特點(diǎn)，吸引了大量研究者的注意［21］.將HA用于載藥納米粒子的包覆，不僅能夠增強(qiáng)其生物相容性，更賦予載體靶向性及酶響應(yīng)性，這將大幅提升治療效果，極具應(yīng)用前景.

本文利用改性的HA、AuNC和鹽酸阿霉素（DOX）通過簡單的一鍋法制備了有機(jī)-無機(jī)核殼結(jié)構(gòu)載藥納米微粒DOX@AuNC@HA（DAH），并在pH=7.4、光熱及透明質(zhì)酸酶存在的條件下監(jiān)測了DAH顆粒在模擬人體環(huán)境中的藥物釋放行為.在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，DAH粒子在化療與光熱治療的協(xié)同治療中展現(xiàn)出較好的靶向性和刺激響應(yīng)性，為開發(fā)低毒、高效的納米載藥體系提供了一條新的途徑（Scheme 1）.

Scheme 1 Modification process of hyaluronic acid(A)and schematic representation of the preparation and drug release behavior of DAH(B)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

水溶性碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，B.R.級）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Mw=30000）、硫化鈉（NaS，純度99%）、丙酮（C3H6O，分析純）和谷胱甘肽（GSH，B.R.級），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，B.R.級）、L-半胱氨酸乙酯鹽酸鹽（LC，純度98%）和乙二醇（EG，純度≥99.5%），阿拉丁試劑有限公司；氯金酸（HAuCl4，Au含量48%～50%）、透明質(zhì)酸酶（HAase，400～1000 U/mg）、青霉素鏈霉素（PS）、胰酶（Trypsin）和多聚甲醛，分析純，Sigma試劑有限公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM，B.R.級）和牛血清（FBS），賽默飛世爾科技公司；透明質(zhì)酸鈉（Mw=3000～10000），華熙福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司；Cell Counting Kit-8試劑（CCK-8），GLPBIO生物試劑有限公司；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所使用的A549細(xì)胞由武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，小鼠成纖維細(xì)胞（L929細(xì)胞）購自武漢普諾塞生物公司；所有實(shí)驗(yàn)所用超純水均由惠儀浦（北京）環(huán)?？萍加邢薰綡YP-QX-UP型超純水機(jī)制得.

Spectrum one型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），美國Perkin-Elmer公司；UV-6100S型紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis），上海精密儀器儀表有限公司；ZS90型激光粒度分析儀，英國Malvern公司；Tecnai G20型透射電子顯微鏡（TEM），美國FEI公司；JSM7100F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會(huì)社；波長671 nm的紅外激光器，北京華源拓達(dá)激光技術(shù)有限公司；SpectraMax iD3型全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀，美國分子設(shè)備公司；Nikon C2型共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 AuNC的合成 參照文獻(xiàn)［22］方法制備AuNC.首先以AgNO3溶液為原料合成銀立方（Ag cube），純化后分散于4 mL超純水中；將5 mL 1 mg/mL的PVP溶液和0.1 mL Ag cube溶液加入到圓底燒瓶中，加熱至輕微沸騰；10 min后，將6 mL 0.1 mmol/L的HAuCl4以45 mL/h的速度滴加到圓底燒瓶中，當(dāng)燒瓶中溶液顏色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)停止滴加，保溫；待液體顏色穩(wěn)定不變后停止加熱，劇烈攪拌，直至反應(yīng)體系冷卻到室溫；將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至離心管中，加入NaCl晶體至達(dá)到飽和，離心富集后，用乙醇與去離子水（體積比為1∶1）的混合物洗滌3次，最后分散于超純水中備用.

1.2.2 透明質(zhì)酸鈉的修飾 將EDC和NHS加入到0.1 mg/mL透明質(zhì)酸鈉溶液中（nHA∶nEDC∶nNHS=1∶1.5∶1.8）；30 min后，逐滴加入L-半胱氨酸乙酯鹽酸鹽溶液，反應(yīng)4 h；然后透析24 h（使用超純水透析，換水3次，每次500 mL），冷凍干燥，得到巰基化的透明質(zhì)酸LC-HA.

1.2.3 阿霉素的負(fù)載與釋放 向AuNC分散液中滴加1 mL 1 mg/mL的DOX溶液，避光攪拌30 min后加入150 mg巰基化的透明質(zhì)酸，低溫避光攪拌72 h；負(fù)載結(jié)束后進(jìn)行離心處理，用超純水洗滌、離心3次去除未裝載的DOX，得到透明質(zhì)酸修飾的負(fù)載DOX的AuNC（DOX@AuNC@HA，即DAH）.利用紫外-可見分光光度計(jì)檢測離心上清液在490 nm處的吸光度，計(jì)算DAH中DOX的載藥量和載藥率.

1.3 光熱轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

分別將1 mL不同濃度的AuNC和DAH懸濁液（10，25和50μg/mL）加入到石英池中，使用激光持續(xù)照射（671 nm，1 W/cm2，10 min），每隔30 s記錄溶液溫度；分別取1 mL 25μg/mL的AuNC和DAH懸濁液，使用不同的激光功率（0.5，1，2 W/cm2）照射10 min，記錄溶液的溫度變化；此外，分別對AuNC和DAH懸濁液進(jìn)行連續(xù)5次升-降溫實(shí)驗(yàn)，考察DAH的光熱轉(zhuǎn)換穩(wěn)定性及光熱轉(zhuǎn)化率［23，24］，每次記錄結(jié)束后等樣品冷卻到室溫后再進(jìn)行下一次循環(huán)實(shí)驗(yàn).

1.4 DAH的體外生物評價(jià)

使用CCK-8試劑盒檢測了DAH對A549細(xì)胞的細(xì)胞活性的影響［25］.將約5000個(gè)A549細(xì)胞接種在96孔板上，待細(xì)胞增殖到鋪滿孔板的70%～80%時(shí)，加入不同濃度的HA，DOX和DAH溶液與細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h.為了研究金納米籠的光熱作用對細(xì)胞活性的影響，添加3組DAH培養(yǎng)的細(xì)胞，每6 h使用不同功率的激光照射10 min，共照射4次；培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3次，加入100μL含有CCK-8的DMEM培養(yǎng)基（VCCK-8∶VDMEM=1∶9），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm處的吸光度.根據(jù)吸光度的值計(jì)算細(xì)胞的活性.

此外，研究了A549細(xì)胞和L929細(xì)胞對DAH的攝取情況.分別將約1×105個(gè)A549細(xì)胞和L929細(xì)胞接種到共聚焦培養(yǎng)皿中孵育24 h；當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時(shí)，分別加入DOX和DAH溶液，共培養(yǎng)4和24 h后，用PBS（pH=7.4）洗滌3次，加入1 mL多聚甲醛置于培養(yǎng)箱中；30 min后，去除上層清液，加入700μL細(xì)胞核著色劑4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），著色5 min后去除上層清液，用PBS（pH=7.4）洗滌3次，再加入l mL PBS（pH=7.4），保持細(xì)胞狀態(tài)；使用激光共聚焦顯微鏡拍攝明場、258和490 nm處的圖像.

2 結(jié)果與討論

2.1 DAH核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的合成與表征

為整合化療與光熱療法的優(yōu)點(diǎn)，提升癌癥治療效果，選擇具有光熱效應(yīng)的AuNC為載藥容器.用LC對HA進(jìn)行巰基化改性，再用改性后的HA通過巰基與金的反應(yīng)對載有DOX的AuNC實(shí)現(xiàn)包封，從而制備了載藥納米微粒DOX@AuNC@HA（DAH），制備過程見Scheme 1.圖1給出LC，DOX，HA及DAH的FTIR譜圖.在DAH的FTIR譜圖中，1752和1228 cm-1處出現(xiàn)了LC的酯羰基的伸縮振動(dòng)特征峰和酯基的不對稱伸縮振動(dòng)特征峰［26］；1286 cm-1處出現(xiàn)了DOX上蒽環(huán)的羰基伸縮振動(dòng)吸收峰［27］；1660和1070～1207 cm-1處出現(xiàn)了HA的糖環(huán)和羧酸的羰基的吸收峰［28］.紅外光譜結(jié)果表明成功合成了改性HA修飾的AuNC負(fù)載DOX的核殼納米粒子.

Fig.1 Infrared spectra of LC,DOX,HA and DAH

Fig.2 UV?Vis spectra of AuNC,AuNC@HA,DOX@AuNC and DAH

圖2為AuNC，AuNC@HA，DOX@AuNC和DAH的紫外-可見吸收光譜.4種物質(zhì)在660～670 nm處都有一個(gè)大的吸收峰，這是AuNC的吸收峰，不同的是，AuNC和DOX@AuNC的吸收峰在660 nm附近，而AuNC@HA和DAH的吸收峰在673 nm附近.這主要是因?yàn)镠A包覆后AuNC的外層介質(zhì)由水變?yōu)榱薍A（由液體變?yōu)楣腆w），導(dǎo)致外層的介電常數(shù)增大，從而使吸收峰發(fā)生紅移［29］.同時(shí)，DOX@AuNC和DAH在491 nm處也都有一個(gè)吸收峰，這是裝載的DOX的特征吸收峰.紫外-可見光譜證明了HA對AuNC成功包覆，DOX也成功被裝載.

圖3（A）為Ag cube的SEM照片.由圖3（A）可見，Ag cube的尺寸比較均勻，其直徑在70 nm左右.由AuNC的TEM照片［圖3（B）］可見，AuNC分散良好，尺寸均勻，可以明顯看出其中空結(jié)構(gòu)，說明AuNC的成功制備.

圖4（A）給出Ag cube，AuNC及DAH的電位圖.由圖4（A）可見，Ag cube的表面電位在-10 mV左右，AuNC的表面電位為-7.8 mV，而DAH的表面電位為-15 mV，說明HA的修飾使AuNC的表面負(fù)電荷增多，這將會(huì)增強(qiáng)納米微粒在體液中的穩(wěn)定性，延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間［2］.圖4（B）為Ag cube，AuNC及DAH的水合動(dòng)力學(xué)粒徑圖.可以看出，AuNC和Ag cube的水合粒徑尺寸相近，大約為70 nm，而DAH由于有HA的包覆，其水合粒徑為110 nm.DAH較小的尺寸將有利于其穿過血管和組織進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部［30］.

Fig.3 SEM image of Ag cube(A)and TEM image of AgNC(B)

Fig.4 Zeta potential(A)and hydrated particle sizes(B)of Ag Cube,AuNC and DAH

2.2 AuNC和DAH的體外光熱性能

Fig.5 Photothermal conversion of AuNC(A,C)and DAH(B,D)at different concentrations(A,B)or different power laser sources(C,D)

以波長為671 nm的激光為光源，考察了不同濃度AuNC和DAH懸濁液的溫度隨照射時(shí)間的變化［圖5（A）和（B）］.經(jīng)過10 min持續(xù)照射后，AuNC和DAH懸濁液的溫度都明顯升高.AuNC濃度為10 μg/mL時(shí)，AuNC和DAH組的溫度增值分別為19.2和20.1℃；AuNC濃度為25μg/mL時(shí)，AuNC和DAH組的溫度增值分別為24.4和29.3℃；AuNC濃度為50μg/mL時(shí)，AuNC組的溫度增值為32.4℃，DAH組增值為33.5℃.溫度的增值在一定范圍內(nèi)與試劑的濃度呈正相關(guān)，相同濃度下DAH組的溫度增值都略高于AuNC組，這可能是因?yàn)榘哺叻肿油鈿ず洼d藥后DAH的吸收峰發(fā)生紅移，更加接近激光的波長，有利于光熱劑吸收更多的光而放出更多的熱［31］.在DAH中AuNC的光熱效果得到增強(qiáng)，能夠更好地滿足殺死腫瘤細(xì)胞的要求［32］.

圖5（C）和（D）示出了AuNC濃度為25μg/mL時(shí)，不同功率激光對AuNC和DAH懸濁液光熱轉(zhuǎn)換性能的影響.可以看出，在0.5 W/cm2功率下，AuNC和DAH升溫較慢，其10 min后的溫度增值分別為11.7和12.3℃；在1和2 W/cm2功率下，AuNC和DAH升溫較快，其中1 W/cm2功率下AuNC和DAH在10 min后的溫度分別升高21.7和25.5℃，2 W/cm2功率下AuNC和DAH的溫度增值分別為30.1和35.4℃.通過溫度的變化可以看出，當(dāng)體系內(nèi)的光熱劑含量一定時(shí)，激光器功率越大，溫度增量就越大，光熱效果總體就越好.這可能是由于激光功率的增加可有效提高單位面積光熱試劑的光熱轉(zhuǎn)換量，從而使得體系表現(xiàn)出溫度的升高［31］.

對25μg/mL的AuNC和DAH懸濁液進(jìn)行光熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)［圖6（A）和（B）］.在1 W/cm2功率下進(jìn)行連續(xù)照射，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過激光反復(fù)連續(xù)照射5次后，其光熱轉(zhuǎn)換能力并未減弱，AuNC在循環(huán)測試中溫度上升快，激光照射10 min后其溫度升高了25.4℃；DAH在升溫實(shí)驗(yàn)中，平均溫度增值也達(dá)到26.8℃.DAH的升溫幅度高于AuNC，擁有較好的光熱穩(wěn)定性，進(jìn)一步證明DAH通過利用光熱用于腫瘤的治療的可行性.根據(jù)光熱轉(zhuǎn)換率計(jì)算公式［23，24］，AuNc和DAH的光熱轉(zhuǎn)換率分別為23.1%和33.1%［圖6（C）和（D）］.可以看出DAH擁有比AuNC更高的光熱轉(zhuǎn)換率，這主要是因?yàn)榻?jīng)過修飾后的AuNC最強(qiáng)吸收峰位置發(fā)生紅移，與實(shí)驗(yàn)中選擇的激光波長更加接近，使得其吸收的光增多而反射的光減少，從而提高了光熱轉(zhuǎn)化率.

Fig.6 Photothermal curves of AuNC(A)and DAH(B)and photothermal effects of AuNC(C)and DAH(D)with cooling period of the time versus negative natural logarithm of the temperature

2.3 DAH的載藥和體外釋放性能

基于AuNC的中空結(jié)構(gòu)和HA的生物相容性，DOX被成功包載到AuNC@HA納米凝膠中.根據(jù)紫外-可見光譜分析結(jié)果計(jì)算得出DAH的載藥率約為28.3%，載藥量為12.5%，說明AuNC@HA納米凝膠具有較好的藥物載運(yùn)能力.

DAH在生物體內(nèi)能否有效釋放內(nèi)部的DOX是判斷載體功能性好壞的重要標(biāo)準(zhǔn)之一.本文通過模擬不同的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，分析了DAH的刺激釋放性能.圖7（A）給出DAH在不同pH環(huán)境下DOX的累計(jì)釋放情況.由圖7（A）可以看出，在pH值為7.4的條件下，DOX的釋放率一直保持在一個(gè)較低的狀態(tài)，20 h的累計(jì)釋放率在20%左右.而在pH值為6.5和5.0時(shí)，20 h后的累計(jì)釋放率分別為55.2%和77.8%，遠(yuǎn)高于在pH值為7.4時(shí)的釋放率.說明DAH在酸性條件下具有明顯的刺激響應(yīng)性，這可能是因?yàn)镠A分子鏈上有眾多的官能團(tuán)（羥基及氨基等），這些官能團(tuán)在酸性條件下能夠結(jié)合溶液中的氫離子而帶上同種電荷，從而打開包覆在AuNC表面的高分子鏈，釋放出DAH粒子中的藥物［33］.DAH在pH值為7.4時(shí)釋放率較低也說明其在該條件下具有良好的穩(wěn)定性.由于血液的pH值接近7.4［34］，因此DAH在血液中將具有良好的穩(wěn)定性，能夠減少藥物的泄露，降低藥物的毒副作用.而腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的微環(huán)境是呈酸性的，在這種酸性環(huán)境下，羥基和氨基能夠更多更快質(zhì)子化，使表面聚合物因帶同種電荷互相排斥而處于“蓬松”狀態(tài)，DAH內(nèi)部的DOX能夠大量地釋放并作用于癌細(xì)胞，達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長或殺死癌細(xì)胞的目的［35］.

Fig.7 DOX cumulative release from DAH under different p H values(A),HAase concentrations in PBS solution(p H=7.4,B),enzyme concentrations in PBS(p H=7.4 or 5.0,C)and laser intermit?tent irradiation at 1,4,8,12 h(D)

圖7（B）給出DAH在不同濃度HAase存在下DOX的釋放情況.由圖7（B）可以看出，HAase對DAH中DOX的釋放有著很大的影響，即使在最低濃度（HAase濃度為1 mmol/L）時(shí)，DOX的累計(jì)釋放率也達(dá)到52%左右.這主要是因?yàn)镠Aase對HA的酶解作用破壞了AuNC表面的包覆層，促進(jìn)了藥物釋放［36］.20 h后，不同濃度HAase下DOX的累計(jì)釋放率分別為52.6%（1 mmol/L），68%（5 mmol/L）和92%（10 mmol/L）.可見，DAH具有良好的酶響應(yīng)性.這主要是因?yàn)镠A能夠與細(xì)胞中的HAase發(fā)生酶解作用，利用這一特點(diǎn)設(shè)計(jì)的DAH納米粒子能夠有效釋放出其內(nèi)部的DOX.

圖7（C）是pH和HAase共同作用于DAH時(shí)，DOX的累計(jì)釋放情況.由圖7（C）可知，在pH值為5.0及酶含量為5 mmol/L的環(huán)境下，DOX釋放率高達(dá)93.2%，釋放效果最佳；而在pH值為7.4及酶含量為5 mmol/L的溶液中，DOX累計(jì)釋放率為75.89%.這主要是因?yàn)樗嵝原h(huán)境下，HAase的活性更高［37］.此外，在pH值為5.0及酶含量為1 mmol/L的溶液中，DOX的累計(jì)釋放率為66.7%；在pH值為7.4及酶含量為1 mmol/L的環(huán)境下，DOX的累計(jì)釋放率只有51%.這也說明酸性條件下HAase的活性較強(qiáng)，有利于藥物釋放.由以上分析可知，HAase對DAH中DOX的釋放影響是絕對的，且酶活性與pH值之間存在協(xié)同作用.

為了探討光熱對DOX釋放的影響，采用激光器在釋放過程中每隔一段時(shí)間照射樣品10 min.DOX的釋放情況如圖7（D）所示，光照后的一段時(shí)間內(nèi)，DOX的釋放有所加快，釋放6 h，累計(jì)釋放率達(dá)到了32%左右；6 h后，這種光照刺激對釋放效率的影響變小，20 h的累計(jì)釋放率達(dá)到50%左右.這說明光照對藥物的釋放有一定的影響.這可能是因?yàn)榧す獾恼丈涫菇鸺{米籠發(fā)生光熱效應(yīng)，使體系溫度升高，體系內(nèi)分子的熱運(yùn)動(dòng)能增加［38］.這將導(dǎo)致原本包覆在DAH表面的高分子鏈發(fā)生運(yùn)動(dòng)及排布變化，使包覆“殼”出現(xiàn)松動(dòng)甚至出現(xiàn)破裂，釋放出DAH內(nèi)部或高分子鏈間隙中的DOX，導(dǎo)致DAH表現(xiàn)出光熱敏感性.

2.4 DAH的生物性能

以A549細(xì)胞為模型，探究了HA、AuNC、游離DOX、DAH及不同功率激光作用下DAH的細(xì)胞毒性.由圖8（A）可見，AuNC在較低濃度時(shí)無細(xì)胞毒性，當(dāng)濃度達(dá)到8μmol/L時(shí)就表現(xiàn)出一定的細(xì)胞抑制作用.不同濃度下的HA均表現(xiàn)出無毒性，說明HA具有良好的生物相容性，作為包封材料能夠減少對正常組織的危害.因此，使用HA修飾AuNC可以有效提高載體的生物相容性.游離DOX和DAH組隨著DOX濃度的增加，細(xì)胞毒性也增強(qiáng).當(dāng)DOX濃度達(dá)到16μmol/L時(shí)，游離DOX組的細(xì)胞存活率為40%，DAH組為33.4%.通過對比可以看出，DAH表現(xiàn)出優(yōu)于游離DOX的藥物活性，這可能與HA的靶向介導(dǎo)有關(guān)，HA的引入提高了DAH進(jìn)入細(xì)胞的效率.

由圖8（B）可見，相同濃度的DAH在不同功率的激光器作用下，細(xì)胞的存活率出現(xiàn)了明顯的差別.DAH濃度為16μmol/L時(shí)，在0.5 W/cm2功率激光照射下細(xì)胞的存活率34.23%，與非光照條件下的結(jié)果（33.44%）接近，說明在低功率激光下光熱效果不明顯，主要靠DOX的化療作用.而在1和2 W/cm2功率激光照射下，細(xì)胞的存活率分別為12.45%和5.36%，與低功率（0.5 W/cm2）激光組及非光照組相比明顯降低，說明在較高功率的激光照射下DAH的光熱能效滿足殺死細(xì)胞的溫度，再結(jié)合DOX的化療效果，使癌細(xì)胞的生長得到有效地抑制.化療與光熱療法的共同作用使DAH表現(xiàn)出更高效的細(xì)胞殺傷性.

Fig.8 Survival rate of A549 cells cultured with HA,AuNC,DOX and DAH(A)and treated with DAH under the action of different laser power for 24 h(B)

通過觀察對比A549和L929細(xì)胞對DAH和游離DOX的攝取情況.圖9給出L929細(xì)胞與游離DOX和DAH共培養(yǎng)24 h后的激光共聚焦圖像.從圖9可以看出，經(jīng)過24 h共培養(yǎng)后，游離DOX組的紅色熒光明顯強(qiáng)于DAH組.這主要是因?yàn)橛坞xDOX是小分子，其通過自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，擴(kuò)散速度快，進(jìn)入細(xì)胞的量更大；而DAH體積較大，只能通過胞吞的方式進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入過程較慢，并在內(nèi)部環(huán)境刺激下才能釋放出DOX.所以游離的DOX會(huì)比DAH更多進(jìn)入到細(xì)胞，甚至細(xì)胞核.

Fig.9 Optical and fluorescence images of L 929 cells treated with free DOX(A 1—A 4)and DAH(B1—B4)for 24 h

Fig.10 Optical and fluorescence images of A549 cells treated with free DOX(A 1—A 4,C1—C4)and DAH(B1—B4,D 1—D4)for 4 h(A 1—A 4,B1—B4)and 24 h(C1—C4,D1—D4)

圖10示出了CD44高表達(dá)的A549細(xì)胞對游離DOX和DAH的攝取情況.可見，游離DOX和DAH與A549細(xì)胞孵育4 h后，兩組細(xì)胞的紅色熒光強(qiáng)度相近.理論上游離DOX在短時(shí)間內(nèi)可以通過自由擴(kuò)散迅速進(jìn)入細(xì)胞，表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光；但由于DAH表面的HA與腫瘤表面的CD44蛋白受體的靶向結(jié)合，加快了DAH進(jìn)入細(xì)胞的速度，導(dǎo)致兩者進(jìn)入細(xì)胞的DOX的量差別較小，熒光強(qiáng)度相當(dāng)［35，39］.隨著DOX在體液中濃度的降低，自由擴(kuò)散的速度也隨之減慢；但DAH通過靶向效應(yīng)及胞吞進(jìn)入細(xì)胞，其進(jìn)入細(xì)胞的速度與濃度無關(guān)，所以DAH能夠始終保持較快的速度進(jìn)入細(xì)胞.于是24 h后DAH組的紅色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于游離DOX組.對比A549和L929對DAH的攝取情況可以看出：DAH對CD44高表達(dá)的A549細(xì)胞具有典型的靶向作用.

3 結(jié) 論

采用簡單的一鍋法合成了以負(fù)載DOX的金納米籠為核、改性透明質(zhì)酸為殼的核殼結(jié)構(gòu)多功能納米載藥體（DAH）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DAH的粒徑在110 nm左右，表面電位為-15 mV.DAH在pH=5.0的PBS中20 h的累計(jì)釋放率為77.8%；與在PBS（pH=7.4）中相比，在不同濃度HAase的PBS溶液中DAH都表現(xiàn)出明顯的釋放增強(qiáng)，表明DAH具有較好的pH和酶響應(yīng)性.此外，DAH擁有較好的光熱轉(zhuǎn)換穩(wěn)定性和較高的轉(zhuǎn)換效率.在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，HA表現(xiàn)出一定范圍內(nèi)完全無毒性，AuNC在較低濃度下也表現(xiàn)為無細(xì)胞毒性，這也表明載體AuNC@HA具有良好的生物相容性；而DAH組在2 W/cm2激光照射后細(xì)胞存活率僅為5.36%，表現(xiàn)出較高的治療性能.更重要的是，透明質(zhì)酸修飾的納米粒子能夠更快更多地被癌細(xì)胞攝取.具有多重敏感性能、可結(jié)合多種療法的納米載藥體系能夠明顯提升對癌癥的治療效果，具有一定的研究價(jià)值.