黃 益，呂玲玲，潘小鵬，孫廣東，李永強(qiáng)，3，姚菊明，邵建中

（1.浙江理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,2.生態(tài)染整技術(shù)教育部工程研究中心,杭州 310018；3.浙江理工大學(xué)桐鄉(xiāng)研究院,桐鄉(xiāng) 314500）

三維（3D）生物打印技術(shù)可將醫(yī)學(xué)影像建模、設(shè)計(jì)和仿真技術(shù)相結(jié)合，具有快速、準(zhǔn)確模擬制備復(fù)雜形狀實(shí)體組織或器官的特點(diǎn)，在人造皮膚、人造心臟及人造血管等生物組織工程領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊［1，2］.應(yīng)用3D生物打印技術(shù)定制人造組織或器官，對(duì)作為“生物墨水”的組織工程支架前驅(qū)液有著極高的應(yīng)用要求，其不僅需具備優(yōu)良的生物相容性、可降解性及合適的流變特性以滿足高精度、流暢噴印的要求［3，4］，且打印后需迅速完成交聯(lián)成型并保持良好的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［5］，這對(duì)“生物墨水”材料的選用與成型效率提出了極大的挑戰(zhàn).

蠶絲再生絲素蛋白具有優(yōu)異的生物相容性（無致敏性和遺傳毒性，可支持各種細(xì)胞的黏附、增殖和分化）及可降解性等特點(diǎn)，在藥物緩釋、傷口敷料和生物支架等生物醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［6～8］.采用絲素蛋白（SF）構(gòu)建上述“生物墨水”可先使用蠶絲制備再生絲素蛋白溶液，后經(jīng)物理或化學(xué)方式交聯(lián)成型構(gòu)建SF凝膠支架.然而，常規(guī)的SF交聯(lián)技術(shù)（包括加熱、超聲、旋渦震蕩及添加表面活性劑等物理交聯(lián)，戊二醛、碳化二亞胺、二縮水甘油醚和京尼平等化學(xué)交聯(lián)，以及辣根過氧化物酶、酪氨酸酶和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等生物酶交聯(lián)）均無法滿足3D打印對(duì)SF“生物墨水”實(shí)時(shí)成型效率的要求［9，10］.此外，高溫交聯(lián)條件和化學(xué)交聯(lián)劑易導(dǎo)致具有生物活性的細(xì)胞和藥物失活［11］.因此，SF的實(shí)時(shí)交聯(lián)成型亟需交叉學(xué)科間的融合與創(chuàng)新來實(shí)現(xiàn)突破.

光交聯(lián)以光波為能量源，通過光激發(fā)分子的化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)聚合交聯(lián)［12］.該技術(shù)具有反應(yīng)速率快、反應(yīng)溫度低及可在特定區(qū)域和官能團(tuán)間反應(yīng)等特點(diǎn)，在生物組織材料的快速制備中優(yōu)勢(shì)顯著［13］.為賦予SF光聚合反應(yīng)能力，研究者主要通過光敏改性劑，如甲基丙烯酸酐（MA）［14］、甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）［15～17］、甲基丙烯酸異氰酸乙酯［18］或降冰片烯二酸酐［19］等對(duì)SF側(cè)鏈上的氨基改性，這雖可滿足SF實(shí)時(shí)交聯(lián)效率的要求，但仍存在接枝率、接枝分布等參數(shù)的反應(yīng)可控性問題［20］，并且光敏性基團(tuán)的引入會(huì)對(duì)SF的生化特性產(chǎn)生一定程度的影響［21］.

在本課題組前期對(duì)光誘導(dǎo)自交聯(lián)研究的基礎(chǔ)上［22～24］，本文采用擠出式3D打印技術(shù)，以三聯(lián)吡啶氯化釕［Ru（Ⅱ）］和過硫酸鉀（KPS）為藍(lán)光引發(fā)體系，開發(fā)了適用于自支撐SF的實(shí)時(shí)光交聯(lián)3D打印技術(shù).通過進(jìn)一步對(duì)打印前驅(qū)液固化速率、氣壓、打印頭移動(dòng)速度及針頭尺寸等參數(shù)的匹配性研究，探明了自支撐SF水凝膠三維支架的原位光交聯(lián)成型加工工藝及精細(xì)化調(diào)控方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

六水合三聯(lián)吡啶氯化釕、過硫酸鉀和聚乙烯吡咯烷酮，分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司；無水氯化鈣和無水乙醇，分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司；脫膠生絲坯布，65 g/cm2，杭州萬事利絲綢數(shù)碼印花有限公司.

MCR52型旋轉(zhuǎn)流變儀，奧地利安東帕有限公司；Omicure S2000型光量熱單元，加拿大EXFO公司；Dispense Mate D-585型點(diǎn)膠系統(tǒng)，美國Nordson公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 SF溶液的制備與濃縮 將20 g脫膠生絲坯布投入到n（CaCl2）∶n（CH3CH2OH）∶n（H2O）=1∶2∶8的三元體系中，在70℃的條件下溶解3 h，冷卻至室溫；將上述溶液轉(zhuǎn)移至纖維素透析袋（截留分子量8000～10000）中，置于去離子水中透析3～4 d；將透析完畢后的SF溶液離心處理（25℃，10000 r/min）約20 min，即得到質(zhì)量濃度為20 g/L（即2.0%）的SF溶液.將制備好的SF溶液裝入透析袋內(nèi)，置于10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的聚乙烯吡咯烷酮溶液中，在5℃下對(duì)SF溶液進(jìn)行反透析，在不同時(shí)間點(diǎn)下依次得到所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)的濃縮SF溶液.

1.2.2 光交聯(lián)SF打印前驅(qū)體的制備 將所需濃度的Ru（Ⅱ）和KPS分別加入到20 g/L SF溶液中，經(jīng)超聲溶解后，置于3℃環(huán)境下閉光保存?zhèn)溆?

1.2.3 流變性能測(cè)試 采用MCR52型旋轉(zhuǎn)流變儀測(cè)試SF溶液的基本流變性能，錐板（CP50）與測(cè)試平臺(tái)間的間隙設(shè)為0.10 mm，將光交聯(lián)SF前驅(qū)液注入錐/平板間的測(cè)試空腔，黏度測(cè)試參數(shù)設(shè)置為：剪切速率為0.1～1000 rad/s，測(cè)試溫度設(shè)為25℃；動(dòng)態(tài)模量測(cè)試參數(shù)設(shè)置為：振幅為0～150%，頻率為10 Hz.

1.2.4 光流變行為分析 以MCR52型旋轉(zhuǎn)流變儀與Omicure S2000型光量熱單元組成光流變測(cè)試系統(tǒng)（Photo-rheology），在振蕩模式下對(duì)SF前驅(qū)液光交聯(lián)過程中的動(dòng)態(tài)模量進(jìn)行測(cè)試［25］.以CP50作為測(cè)試附件，設(shè)置測(cè)試間距0.1 mm，振幅10%及頻率10 Hz，對(duì)SF前驅(qū)液進(jìn)行時(shí)間掃描，在30 s避光掃描后啟動(dòng)藍(lán)光輻照（19.0 mW/cm2）.將凝膠點(diǎn)（Gel point）及黏彈性轉(zhuǎn)變時(shí)間tgel分別定義為儲(chǔ)能模量（G′）與損耗模量（G″）交點(diǎn)及其出現(xiàn)的時(shí)間.損耗因子tanδ為G″與G′的比值.

1.2.5 光交聯(lián)SF的實(shí)時(shí)擠出成型加工 以10 mL注射器和50 mm聚氯乙烯PVC透明管（φ0.5 mm和φ1.0 mm）組成簡(jiǎn)易擠出式打印頭，模擬SF的實(shí)時(shí)光交聯(lián)擠出成型加工.添加SF光交聯(lián)前驅(qū)體后，緩慢擠壓使前驅(qū)體進(jìn)入透明針頭的同時(shí)，開啟藍(lán)光光源并使光斑照射在針頭前中部，持續(xù)緩慢推壓活塞使已交聯(lián)SF水凝膠以約1 mm/s的速度擠出針頭.光交聯(lián)三維成型加工系統(tǒng)由Dispense Mate D-585型點(diǎn)膠系統(tǒng)與藍(lán)光輻照系統(tǒng)兩部分組成.以棕色針管作為打印前驅(qū)體存儲(chǔ)裝置，并配備不同尺寸的打印針頭，以O(shè)micure S2000型光量熱單元提供藍(lán)光（氙燈加載400～500 nm截止濾光片）并通過光纖導(dǎo)出.在計(jì)算機(jī)Fluid Move軟件控制系統(tǒng)中設(shè)計(jì)打印圖案，設(shè)置噴頭系統(tǒng)的移動(dòng)速度、針頭高度等，調(diào)節(jié)光強(qiáng)和氣壓以保證水凝膠能夠流暢擠出.

2 結(jié)果與討論

2.1 SF溶液的流變性能

SF生物支架材料的流變學(xué)特性是實(shí)現(xiàn)其3D打印的關(guān)鍵，因此有必要對(duì)SF溶液的流變性能和可打印性進(jìn)行研究.圖1（A）示出不同濃度SF溶液的流變性能.在剪切應(yīng)力作用下，低濃度SF溶液［w（SF）＜10%］表現(xiàn)出剪切稀化行為.當(dāng)w（SF）＞15%時(shí)，隨著剪切速率的增加，黏度保持基本穩(wěn)定.分析認(rèn)為高濃度SF溶液［w（SF）＞15%］中大分子鏈的流動(dòng)性降低，從而影響其大分子的自組裝和排列行為［26］.此外，SF溶液的黏彈行為顯示，當(dāng)w（SF）＜20%時(shí)普遍表現(xiàn)為典型的黏性行為（G″＞G′）［圖1（B）］.上述純SF溶液的流變特性分析表明，其無法滿足擠出式3D打印對(duì)材料成型性、保型性及打印精度的要求.

2.2 光誘導(dǎo)SF自交聯(lián)反應(yīng)

純SF三維成型加工的關(guān)鍵在于開發(fā)與3D打印技術(shù)相適應(yīng)的交聯(lián)方法，以實(shí)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.本課題組前期工作已對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)下Ru（Ⅱ）/KPS體系與絲素蛋白氨基酸側(cè)基間的光化學(xué)反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究［22］.Scheme 1示出了在藍(lán)光引發(fā)體系下Ru（Ⅱ）/KPS的光化學(xué)反應(yīng).Ru（Ⅱ）分子為以Ru原子為中心的3個(gè)互相垂直的平面聯(lián)吡啶結(jié)構(gòu).在藍(lán)光（主波長為465 nm）輻照下，激發(fā)態(tài)Ru（Ⅱ）*可與KPS發(fā)生受自由擴(kuò)散控制的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成Ru3+，S及S光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物，其中Ru3+和S均具有較強(qiáng)的氧化性，可將相鄰SF大分子鏈上的酪氨酸殘基氧化為酪氨酸自由基，進(jìn)而耦合交聯(lián)為二酪氨酸結(jié)構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)SF的光誘導(dǎo)自交聯(lián)反應(yīng).以Ru（Ⅱ）/KPS作為藍(lán)光引發(fā)體系，在465 nm波長藍(lán)光輻照下即可實(shí)現(xiàn)SF水凝膠的固化成型（Scheme 2）.對(duì)SF水凝膠進(jìn)行結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性測(cè)試，結(jié)果表明該光交聯(lián)SF水凝膠可承受73%振幅范圍內(nèi)的剪切作用，具有較好的抗剪切穩(wěn)定性（圖2）.此外，抗壓機(jī)械性能測(cè)試結(jié)果表明，該光交聯(lián)SF水凝膠在100 g壓力作用下仍可保持結(jié)構(gòu)完整（圖3）.利用SF本身的光化學(xué)特性，可實(shí)現(xiàn)SF大分子在藍(lán)光誘導(dǎo)下的自交聯(lián)反應(yīng)，這為光交聯(lián)SF水凝膠材料的三維成型建立了理論和應(yīng)用基礎(chǔ).

Fig.1 Shear viscosity(A)and dynamic modulus(B)of silk fibroin solution at different concentrations

Scheme 1 Photochemical reaction of Ru(Ⅱ)/KPS under blue light irradiation

Scheme 2 Crosslinking structure of photocured SF hydrogel

Fig.2 Dynamic shear modulus of the photocured SF hydrogel under different shear strain amplitude

Fig.3 Compression test of photocured SF hydrogel

2.3 SF光交聯(lián)動(dòng)力學(xué)

為研究藍(lán)光誘導(dǎo)Ru（Ⅱ）/KPS引發(fā)SF自交聯(lián)行為和交聯(lián)動(dòng)力學(xué)，采用光流變測(cè)試系統(tǒng)監(jiān)測(cè)SF光交聯(lián)實(shí)時(shí)凝膠化行為.光交聯(lián)SF的動(dòng)態(tài)剪切模量變化可用來描述其時(shí)間依賴的黏彈性行為.光敏劑用量對(duì)SF光交聯(lián)行為具有重要影響，圖4（A）示出了不同光敏劑Ru（Ⅱ）用量下SF的黏彈性行為.SF的凝膠化過程主要由其G′（即彈性行為）的增長所主導(dǎo)，即隨著SF大分子間耦合交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，水凝膠材料的黏性行為基本不變，而彈性行為逐漸增強(qiáng)，彈性行為的增長速率反映了SF的光交聯(lián)效率.圖4（B）為不同光敏劑Ru（Ⅱ）用量下光交聯(lián)SF損耗因子（tanδ）的變化.損耗因子整體呈下降趨勢(shì)，同樣驗(yàn)證了SF光交聯(lián)過程中彈性行為的變化.

Fig.4 Dynamic modulus(A)and damage factor(B)of SF during photocuring

隨著光交聯(lián)時(shí)間的延長，不同濃度的Ru（Ⅱ）下SF的G′逐漸增大；同時(shí)，隨著Ru（Ⅱ）增加，G′整體上呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在0.05 mmol/L Ru（Ⅱ）條件下，SF的光交聯(lián)效率達(dá)到最大.光交聯(lián)SF的黏彈性轉(zhuǎn)變點(diǎn)（G′=G″或tanδ=1）顯示出同樣的變化規(guī)律.這一現(xiàn)象可歸因于自由基光引發(fā)過程中的“濾鏡效應(yīng)”［27］，即光引發(fā)劑含量增加到一定程度時(shí)，前驅(qū)液表層引發(fā)劑分子吸收大部分光子能量，降低了下層引發(fā)劑對(duì)光能的吸收，導(dǎo)致內(nèi)部SF大分子出現(xiàn)交聯(lián)程度下降、交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)不勻的現(xiàn)象.

此外，由于光交聯(lián)SF存在的弱凝膠化效應(yīng)（G′＜100 Pa），在較短時(shí)間范圍內(nèi)（20 min）光交聯(lián)SF往往難以達(dá)到其最終的G′.為了對(duì)SF整體的光交聯(lián)行為進(jìn)行量化和預(yù)測(cè)，采用自由基光聚合交聯(lián)凝膠動(dòng)力學(xué)模型［式（1）］［22］對(duì)不同光敏劑用量下SF的光交聯(lián)行為進(jìn)行擬合處理［圖5（A）］：

結(jié)果表明，SF的光交聯(lián)凝膠化行為遵循指數(shù)函數(shù)增長模型.利用式（1）可對(duì)SF最終的理論彈性模量（G′∞）進(jìn)行量化和預(yù)測(cè)，為光交聯(lián)速率低且難以在短時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)到完整凝膠化行為的體系提供有效的數(shù)學(xué)模型.此外，還可利用該凝膠化方程對(duì)SF光交聯(lián)反應(yīng)程度進(jìn)行調(diào)控，以滿足實(shí)際加工需求.

Fig.5 Fitting results of dynamic storage modulus(A)and t gel&G′∞(B)of photocured silk fibroin

以黏彈性轉(zhuǎn)變時(shí)間tgel和G′∞為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)不同引發(fā)體系用量下SF的光交聯(lián)效率進(jìn)行對(duì)比.由圖5（B）可知，當(dāng)Ru（Ⅱ）的濃度大于0.5 mmol/L時(shí)，tgel逐漸增大，G′∞較為穩(wěn)定，表明盡管“濾鏡效應(yīng)”造成SF交聯(lián)效率的整體下降，但充足的光照時(shí)間可使其彈性保持相對(duì)穩(wěn)定.需要注意的是，在0.01 mmol/L微量光敏劑Ru（Ⅱ）引發(fā)下，光交聯(lián)SF凝膠材料可獲得最大的G′∞和較高的凝膠效率（G′∞：約1700 Pa，tgel：18 s）.隨著光敏劑用量的增加，“濾鏡效應(yīng)”愈加顯著并影響SF的光交聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致交聯(lián)度的下降.因此在實(shí)際應(yīng)用過程中應(yīng)優(yōu)化Ru（Ⅱ）用量，以降低“濾鏡效應(yīng)”對(duì)SF光交聯(lián)的影響.

2.4 SF實(shí)時(shí)光交聯(lián)打印

將藍(lán)光誘導(dǎo)SF的自交聯(lián)特性和擠出式3D打印技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種可自支撐SF水凝膠的實(shí)時(shí)光交聯(lián)3D成型技術(shù)［圖6（A）］.該技術(shù)的創(chuàng)新之處在于利用0.01 mmol/L Ru（Ⅱ）/0.05 mmol/L KPS引發(fā)下SF的高效、快速光交聯(lián)固化特性，在透明打印針頭部位經(jīng)藍(lán)光輻照實(shí)現(xiàn)SF的原位交聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)氣壓作用擠出針頭，同時(shí)在三維移動(dòng)系統(tǒng)的配合下，實(shí)現(xiàn)SF水凝膠的三維成型加工.為驗(yàn)證該技術(shù)的可行性，首先采用手工模擬方式測(cè)試SF在兩種不同孔徑透明管狀針頭中的交聯(lián)行為及擠出成型效果［圖6（B）］.兩種不同直徑（φ0.5 mm和φ1.0 mm）的線條狀SF光交聯(lián)水凝膠樣品表面光滑，具有良好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和自支撐性，可滿足SF溶液的實(shí)時(shí)光交聯(lián)擠出成型加工要求.在優(yōu)選打印針頭的基礎(chǔ)上，光交聯(lián)SF水凝膠的三維成型還需要解決兩個(gè)技術(shù)要點(diǎn)：（1）SF水凝膠光交聯(lián)速率與擠出速率的匹配；（2）SF水凝膠擠出速度與三維移動(dòng)速度的匹配.

Fig.6 Real?time light crosslinking 3D printing for silk fibroin

用于SF實(shí)時(shí)光交聯(lián)擠出成型加工的打印裝置改裝效果如圖6（C）所示，最終需要保證光斑落點(diǎn)位于透明打印針頭上且與針頭始終保持相對(duì)靜止.SF光交聯(lián)前驅(qū)體在氣壓的作用下被擠壓進(jìn)入透明針頭，并經(jīng)藍(lán)光輻照快速交聯(lián)固化，在擠出打印針頭后隨著針頭的三維移動(dòng)而成型.由此可知，SF最終的成型狀態(tài)將很大程度上取決于透明針頭的內(nèi)部構(gòu)造，因此可以通過調(diào)節(jié)針頭內(nèi)部尺寸實(shí)現(xiàn)對(duì)SF光交聯(lián)水凝膠最終成型狀態(tài)的有效調(diào)控.采用4種不同內(nèi)徑的自制透明針頭對(duì)SF實(shí)時(shí)光交聯(lián)固化3D打印效果進(jìn)行測(cè)試［圖6（D）］.SF水凝膠樣品的形態(tài)可根據(jù)針頭尺寸進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)水凝膠樣品在擠出打印成型過程中仍能保持結(jié)構(gòu)完整.

SF光交聯(lián)前驅(qū)體［0.01 mmol/L Ru（Ⅱ），0.30 mmol/L KPS及5%SF溶液］在表1列出的打印工藝參數(shù)下，采用兩種孔徑（φ1.0 mm和2.0 mm）針頭時(shí)制得的單層及多層結(jié)構(gòu)SF水凝膠樣品如圖7所示.通過對(duì)光照強(qiáng)度、光斑大小及氣壓等因素的調(diào)控，以兩種不同內(nèi)徑透明針頭（φ1.0 mm和φ2.0 mm）可加工制備單層及多層結(jié)構(gòu)的SF水凝膠樣品，其圓柱狀水凝膠線條直徑分別保持在1.0 mm和1.8 mm左右，SF水凝膠呈半透明，具有微彈性；所制得的SF水凝膠在雙層和三層等三維結(jié)構(gòu)中可實(shí)現(xiàn)自支撐，未出現(xiàn)結(jié)構(gòu)坍塌現(xiàn)象，表現(xiàn)出較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，表明該體系在復(fù)雜結(jié)構(gòu)三維打印成型中具有開發(fā)潛力.

Table 1 Optimal printing parameters for two kinds of silk fibroin hydrogels

Fig.7 Designed patterns and photographs of the printed silk fibroin hydrogel

3 結(jié) 論

SF溶液普遍表現(xiàn)出黏性特征，具有較低黏度（＜0.2 Pa·s）和較差的打印性及保形性.藍(lán)光誘導(dǎo)下Ru（Ⅱ）/KPS可通過將相鄰SF大分子鏈上的酪氨酸殘基氧化為酪氨酸自由基，進(jìn)而耦合交聯(lián)為二酪氨酸結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)SF的自交聯(lián)凝膠化反應(yīng).SF的凝膠化過程主要由其儲(chǔ)能模量（G′）的增長行為所主導(dǎo)，且在較高Ru（Ⅱ）用量（c＞0.05 mmol/L）下會(huì)出現(xiàn)“濾鏡效應(yīng)”，導(dǎo)致SF光交聯(lián)效率下降.在0.01 mmol/L Ru（Ⅱ）條件下SF體系具有較高的凝膠效率（G′∞：ca.1700 Pa，tgel：18 s）.以該體系作為打印前驅(qū)體，通過對(duì)光照強(qiáng)度、光斑大小、氣壓及針頭移動(dòng)速度等參數(shù)進(jìn)行調(diào)控，制備了由直徑1 mm和2 mm SF水凝膠線條堆積而成的可自支撐三維支架材料，為蠶絲絲素蛋白在3D生物打印材料中的應(yīng)用進(jìn)行了有益探索.