林曉溪，張俊毅

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)赤峰學(xué)院培養(yǎng)基地，內(nèi)蒙古 赤峰 024099；2.赤峰市醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024099；3.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024099；4.赤峰學(xué)院臨床病理研究所，內(nèi)蒙古 赤峰 024099)

食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)為常見的食管癌類型，患者生存率較低，預(yù)后不良[1]。近年盡管手術(shù)、放化療等技術(shù)得到提升，但ESCC治療效果并未得到明顯改善，除部分可利用消化內(nèi)鏡切除的食管早期病變之外，大多數(shù)ESCC患者5年生存率仍處于較低水平，預(yù)后不佳[2]。因此，采取行之有效的方式準(zhǔn)確預(yù)測ESCC患者預(yù)后對臨床進(jìn)一步治療及隨訪意義重大。TNM分期是評估ESCC患者預(yù)后的重要方式，但TNM分期對于不能進(jìn)行手術(shù)的患者仍存在局限性，部分患者無法明確分期，且對于僅能獲得小標(biāo)本的患者更是如此[3-4]。斑菲素蛋白2(Plakophilin 2，PKP2)屬于細(xì)胞黏附分子連環(huán)蛋白catenin家族成員之一，主要定位于橋粒，參與穩(wěn)定細(xì)胞黏附連接作用，對維持細(xì)胞橋粒功能具有重要意義[5]。PKP2不僅對信號傳導(dǎo)及細(xì)胞連接具有一定作用，而且參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。目前關(guān)于PKP2用于評價(jià)惡性腫瘤及預(yù)后的研究較少，而將其在ESCC中的表達(dá)意義也未見報(bào)道。基于此，本研究分析PKP2在ESCC中的表達(dá)意義，以探究該指標(biāo)用于預(yù)測ESCC患者預(yù)后的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院2010年1月至2015年12月收治的115例ESCC患者的組織標(biāo)本和20例癌旁正常食管組織標(biāo)本。另選取15例冰凍新鮮食管癌標(biāo)本及癌旁正常食管上皮標(biāo)本提取RNA用來檢測PKP2的表達(dá)。115例ESCC患者中，男性87例，女性28例；中位年齡57歲；腫瘤pTNM分期[7]中，Ⅰ期14例，Ⅱ期45例，Ⅲ期56例，Ⅳ期0例；分化程度[8]中，高分化20例，中分化84例，低分化11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例；27例腫瘤最長徑>3 cm，88例≤3 cm；食管上段7例，中段50例，下段58例。患者術(shù)后隨訪資料完整。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為ESCC；患者資料完整，包括本研究所需資料；術(shù)前未接受其他抗腫瘤治療；無其他良惡性腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：因嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥或其他原因?qū)е碌牟∷阑颊撸恍g(shù)前發(fā)生全身轉(zhuǎn)移者；既往存在其他惡性腫瘤病史；合并肝功能衰竭、腎功能衰竭等其他重要臟器疾病者；合并血液系統(tǒng)疾病者；伴免疫系統(tǒng)疾病者等。

1.2 試劑與儀器 鼠抗人單克隆抗體PKP2(批號：20090816、20110626、20130507，美國Santa Cruz公司)；免疫組化試劑盒(PV-9000，上海欣奧盛)；DAB 酶底物顯色試劑盒(福州邁新生物公司)；圖像采集分析系統(tǒng)、石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 制備組織芯片：組織標(biāo)本用10%的中性福爾馬林溶液固定，由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師對癌組織及癌旁組織取材，常規(guī)脫水，浸蠟包埋。制備組織芯片前進(jìn)行HE染色，選擇蠟塊上具有代表性區(qū)域，用組織點(diǎn)樣儀在蠟塊上取孔，獲得組織條(直徑約為1.5 mm)，再使用蠟塊模打孔儀制作組織芯片蠟塊。切片4 μm厚的組織芯片，撈片置于陽離子防脫載玻片上，制成組織芯片，并由病理科醫(yī)師判讀確認(rèn)取點(diǎn)正確。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色：采用二步法免疫組織化學(xué)染色法。檢測開始前，將組織芯片的切片置于恒溫箱中烤片，脫蠟水洗，進(jìn)行微波抗原修復(fù)(95 ℃)。切片與一抗孵育過夜。沖洗后進(jìn)行DAB顯色，復(fù)染。結(jié)果判定：在光鏡下進(jìn)行觀察，計(jì)400個(gè)細(xì)胞。①染色強(qiáng)度：0分為陰性，弱陽性、中度、強(qiáng)陽性分別記為1、2、3分。②陽性細(xì)胞數(shù)：0分為無；1分為0%～25%；2分為25%～50%；3分為50%～75%；4分為75%以上。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞數(shù)評分乘積為最終得分，低于2分為陰性表達(dá)，反之為陽性表達(dá)。

1.3.3 PKP2 mRNA相對表達(dá)量檢測：以β-actin為內(nèi)參，采用RT-PCR方法檢測PKP2 mRNA相對表達(dá)量。測量3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 癌旁組織與ESCC組織免疫組化染色結(jié)果比較 見圖1。20例癌旁組織中，PKP2陽性信號主要定位在細(xì)胞質(zhì)，且表達(dá)微弱，依據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)被評為陰性。115例ESCC組織中，PKP2陽性信號主要定位在細(xì)胞質(zhì)，且陽性細(xì)胞數(shù)與染色強(qiáng)度顯著增加，其中54例患者呈陽性表達(dá)，占比46.96%(54/115)，較癌旁正常食管上皮表達(dá)(0/20)顯著增高(χ2=15.652，P<0.001)。

2.2 PKP2表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 見表1。陽性表達(dá)組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM高分期占比較陰性表達(dá)組高(均P<0.05)。兩組其他項(xiàng)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

2.3 不同PKP2表達(dá)患者生存情況分析 見圖2。54例PKP2陽性表達(dá)患者隨訪結(jié)束后，死亡44例，病死率為81.48%。61例PKP2陰性表達(dá)患者隨訪結(jié)束后，死亡30例，病死率為49.18%。PKP2陽性表達(dá)組患者病死率高于陰性表達(dá)組(χ2=11.88，P=0.001)。生存分析發(fā)現(xiàn)，PKP2陽性表達(dá)患者的總生存時(shí)間為(24.173±2.045)個(gè)月，短于陰性表達(dá)組的(38.472±2.769)個(gè)月(t=31.157，P<0.001)。

圖1 正常食管組織及ESCC組織中PKP2免疫組化染色結(jié)果(×200)

表1 PKP2表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系(例)

圖2 不同PKP2表達(dá)患者Kaplan-Meier生存分析曲線

2.4 癌旁組織與ESCC組織PKP2 mRNA表達(dá)比較 見圖3。癌旁組織中PKP2 mRNA平均灰度值為0.25±0.07，而ESCC組織PKP2 mRNA平均灰度值為0.86±0.03，ESCC組織中PKP2 mRNA平均灰度值高于癌旁組織(t=65.638，P<0.05)。

圖3 三對癌旁組織(N)和ESCC組織(T)中

2.5 PKP2預(yù)測價(jià)值分析 將表1中初次經(jīng)卡方檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的臨床病理參數(shù)(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期)作為狀態(tài)變量，將PKP2表達(dá)作為檢驗(yàn)變量，繪制ROC曲線進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PKP2高表達(dá)用于預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期的AUC分別為0.785(95%CI：0.648～0.801，P<0.001)和0.763(95%CI：0.629～0.797，P<0.001)，因此具有一定預(yù)測價(jià)值。

3 討 論

ESCC是常見的食管癌類型，若得不到及時(shí)、有效的診治，腫瘤細(xì)胞不斷擴(kuò)散，將增加遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致患者病死[9-10]。目前外科手術(shù)仍是ESCC首選治療方式，可有效切除病灶，改善患者臨床癥狀。但研究[11]發(fā)現(xiàn)，ESCC患者術(shù)后5年生存率并無顯著提高。因此，尋求科學(xué)有效的可預(yù)測ESCC患者預(yù)后的指標(biāo)成為臨床研究重難點(diǎn)。既往研究表示，年齡、病理分期、腫瘤分化程度、腫瘤部位等因素與ESCC患者的預(yù)后有密切聯(lián)系，但近年發(fā)現(xiàn)年齡、疾病分期等相似患者的預(yù)后也有差異[12-13]。這可能與基因、多步驟等參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展有關(guān)[14]。

PKP蛋白主要包括PKP1、PKP2、PKP3，所有p120ctn家族成員分子結(jié)構(gòu)中均含45個(gè)氨基酸，主要定位在橋粒[15]。PKP蛋白與p120ctn參與穩(wěn)定細(xì)胞黏附連接作用相似，在維持細(xì)胞橋粒中起到重要作用。此外，研究顯示該家族很多成員在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中起到重要作用。研究[16-17]報(bào)道，PKP3在非小細(xì)胞肺癌中呈高表達(dá)，與患者預(yù)后具有密切聯(lián)系，且對該蛋白進(jìn)行干擾后腫瘤細(xì)胞的生長也受到明顯抑制。另有研究[18]發(fā)現(xiàn)，PKP3蛋白中mRNA增高對早期診斷胃腸道腫瘤有一定提示作用。研究[19]顯示，在頭頸部鱗癌中PKP1 mRNA過表達(dá)，且與PKP結(jié)構(gòu)相似的p120ctn異常表達(dá)也與惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。而PKP2作為p120ctn家族成員之一，推測其可能與腫瘤進(jìn)展存在一定聯(lián)系，但目前關(guān)于其與ESCC患者的預(yù)后關(guān)系研究更少。

本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，PKP2在ESCC組織中表達(dá)更高，且陽性表達(dá)組患者TNM高分期占比、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于陰性表達(dá)者，提示PKP2在ESCC中發(fā)揮促癌基因作用，其表達(dá)水平升高可能參與并推動腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。另外，研究結(jié)果也提示PKP2表達(dá)增高是由其基因在癌組織中高表達(dá)所致。生存分析發(fā)現(xiàn)，PKP2陽性表達(dá)組患者的總生存時(shí)間短于陰性表達(dá)者，提示PKP2陽性表達(dá)可能與ESCC患者生存時(shí)間有關(guān)。分析原因可能為：PKP2作為PKP蛋白家族成員，在上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過誘導(dǎo)表皮生長因子受體磷酸化并促進(jìn)其活化介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長信號，激活下游信號途徑，從而刺激ESCC腫瘤細(xì)胞異常增殖，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。PKP2也是一種橋粒結(jié)構(gòu)成分，可以作為多功能支架進(jìn)行黏附和信號傳遞，其高表達(dá)可通過調(diào)節(jié)局部黏附動力學(xué)和整合素蛋白表達(dá)支持腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，從而影響ESCC患者的預(yù)后。Fujita等[20]研究證實(shí)，PKP2表達(dá)與食管癌患者生存時(shí)間有關(guān)，本研究結(jié)果與之相符。ROC曲線分析結(jié)果顯示，PKP2陽性表達(dá)可能預(yù)示ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM高分期風(fēng)險(xiǎn)，此時(shí)臨床需結(jié)合該特征進(jìn)行早期預(yù)測、診斷并干預(yù)，以最大限度地提高患者生存率。

綜上所述，ESCC患者PKP2較癌旁組織表達(dá)增高，用于預(yù)測ESCC患者生存情況、TNM分期及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等有一定應(yīng)用價(jià)值。但PKP2具體作用機(jī)制尚未明確，尚無較多循證學(xué)依據(jù)可作為理論支持；且本研究受納入樣本量及隨訪時(shí)間等限制，結(jié)果可能存在一定偏倚，研究仍有局限，對于PKP2表達(dá)是否能夠作為ESCC預(yù)后預(yù)測因子還需今后進(jìn)一步研究證實(shí)。