白治苗，劉玉鋒，郭玉琳，趙 樂

(1.榆林市第二醫(yī)院婦科，陜西 榆林 719053；2.榆林市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 榆林 719053)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，EMS)是具有生物活性的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在宮腔以外任何部位，好發(fā)于育齡期女性，以25～45歲為甚，生育少且晚的婦女發(fā)病概率明顯低于生育多者。研究[1-4]發(fā)現(xiàn)EMS是引發(fā)20%～90%患者出現(xiàn)慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)，25%～35%患者不孕以及5%～15%婦科手術(shù)的根本原因。每個人對EMS的易患性受遺傳、體內(nèi)性激素及環(huán)境因素的共同影響。當前EMS的明確病因及機制尚無定論，但被統(tǒng)一接受的是1921年Sampon提出的經(jīng)血逆流學(xué)說[5-6]，但是該學(xué)說的具體分子機制及細胞因子通路仍不明確。因EMS患者子宮內(nèi)膜組織可侵襲、轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)任何器官，影響相應(yīng)器官功能，出現(xiàn)相應(yīng)癥狀，對女性健康危害較大[7-9]。EMS在病理診斷上是良性的，但病理和發(fā)病機制卻類似于惡性腫瘤，如黏附、侵襲及遠處轉(zhuǎn)移等生物學(xué)能力。當前對EMS的診治手段有限。研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，核因子(Nuclear factor，NF)-κB、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)-9在EMS患者中高表達，且呈正相關(guān)。針對大鼠EMS模型的實現(xiàn)[12]亦證實上述因子高表達，且與子宮內(nèi)膜異位黏附、侵襲性明顯相關(guān)。有研究[13]在對大鼠EMS模型行OPN基因敲除后發(fā)現(xiàn)病灶較前明顯縮小，但是對于OPN如何發(fā)揮作用并未給出明確的結(jié)果。研究[14]發(fā)現(xiàn)OPN與其受體結(jié)合后激發(fā)NF-κB及其相關(guān)通路因子，致使該因子從NF-κB-IkBs復(fù)合物中分離，從胞質(zhì)進入胞核后具有活性，與其他因子發(fā)生結(jié)合后可參與相關(guān)基因的有關(guān)細胞凋亡及轉(zhuǎn)錄調(diào)控。所以，OPN可能是導(dǎo)致EMS發(fā)生，子宮內(nèi)膜遠處黏附、侵襲的關(guān)鍵因子。鑒于此，本研究通過沉默OPN基因觀察EMS患者在位內(nèi)膜細胞侵襲性的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本實驗所獲取的子宮內(nèi)膜組織來源于從2019年1月至2020年1月因“單側(cè)或雙側(cè)卵巢巧克力囊腫”于我院行腹腔鏡下卵巢囊腫剝除術(shù)的患者20例。在手術(shù)中刮取子宮內(nèi)膜組織，且根據(jù)末次月經(jīng)計算均處于月經(jīng)分泌期(前期實驗發(fā)現(xiàn)分泌期OPN的表達高于增殖期)。

1.2 主要試劑 OPN多克隆抗體(批號：716-456-142，稀釋濃度1∶100，美國Abcam公司)；DAB顯色試劑盒(批號：180704，北京中杉生物工程公司)；PV-6001試劑盒(北京中杉生物工程公司)；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑(上海生工生物工程有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；特異小RNA(siRNA)片段(上海吉瑪生物制藥有限公司)；細胞培養(yǎng)小室(密理博中國有限公司)；RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 原代細胞培養(yǎng)及鑒定：將手術(shù)中刮取的內(nèi)膜組織于低溫條件下帶入細胞間，用PBS溶液沖洗數(shù)次后放置于培養(yǎng)皿中，剪刀剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，倒入10 ml離心管中，加入5 ml 0.03% Ⅳ膠原酶，在37 ℃條件下反復(fù)消化3次，每次8 min。于離心器中以500 r/min離心30 s。反復(fù)離心后結(jié)合顯微鏡下觀察，獲得子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，添加細胞培養(yǎng)液，打勻后分至80～100 mm培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日更換細胞培養(yǎng)液，直至達到90%融合。免疫細胞化學(xué)鑒定：待細胞融合至90%，用0.25%胰酶將其消化，用一次性吸管將細胞懸液滴至預(yù)先放有蓋玻片的6孔板中，將6孔板放置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱進行細胞爬片。于第 7 天用無水乙醇固定細胞約 10 min。滴加一抗(鼠抗人細胞角蛋白多克隆抗體和鼠抗人波形蛋白抗體稀釋濃度均為1∶100)4 ℃孵育過夜。滴加二抗(PV6000)，DAB 顯色。細胞質(zhì)被染成棕黃色視為陽性。

1.3.2 OPN siRNA干預(yù)：當細胞融合度為90%時行siRNA干預(yù)。用500 μl無血清培養(yǎng)基稀釋10 μl Trans Lipid HL(北京全式金公司)，500 μl無血清培養(yǎng)基稀釋10 μl OPN siRNA，靜置5 min后將稀釋好的OPN siRNA與Trans Lipid HL輕柔混合，室溫靜置20 min后將混合物加入含5 ml無血清培養(yǎng)液的60 mm培養(yǎng)皿中作為干預(yù)組，將不加混合物的培養(yǎng)皿(加入等量培養(yǎng)液)作為未干預(yù)組。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 OPN siRNA序列：正義鏈為5’-GGUCAAAAUCUAAGAAGUUTT-3’，反義鏈為5’-AACUUCUUAGAUUUUGACCTC-3’。 未干預(yù)組無意義鏈siRNA序列：正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUG-

ACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.3.3 RT-PCR檢測mRNA表達：提取原代細胞中RNA并設(shè)計引物。OPN正向引物序列為5’-ACAGCCGTGGGAAGGACAGTTA-3’，反向引物序列為5’- CCTGACTATCAATCACATCGGAATG-3’。β-actin正向引物序列為5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’。按照北京中杉公司cDNA合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，取4～5 μl反應(yīng)產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳。OPN的相對表達量采用2-△△CT計算。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達：提取細胞中蛋白，采用凱基蛋白提取試劑盒檢測蛋白表達(根據(jù)說明書，OPN按1∶100稀釋)。制備SDS分離膠、濃縮膠，插入相應(yīng)的梳子，加入干預(yù)前后蛋白樣品及標準蛋白標志物，電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)印蛋白于硝酸纖維素膜。載有蛋白的硝酸纖維素膜經(jīng)5% 脫脂牛奶封閉后，加入OPN及β-actin等一抗4 ℃過夜，經(jīng)TBST換洗5 min×5次后，加相應(yīng)二抗孵育2 h，進行增強型ECL顯影，于Bio-Rad成像儀中曝光成像并測定各蛋白條帶光密度值，計算相應(yīng)的光密度比值。

1.3.5 穿膜實驗：制備細胞懸液，當培養(yǎng)于60 mm培養(yǎng)皿中腺上皮細胞及OPN siRNA干預(yù)24 h后的原代細胞融合大約80%～90%時，采用胰酶消化，用細胞培養(yǎng)液將其制成原代細胞懸液，計數(shù)后將細胞懸液加入小室(ECM550，購置于Chemicon公司)中，把侵襲小室的膜置于載玻片上，蓋上蓋玻片，行蘇木素染色后于顯微鏡下行細胞計數(shù)和拍照，每張分別選取16個固定位置的視野，計數(shù)細胞數(shù)量并比較OPN siRNA干預(yù)前后腺上皮細胞穿膜數(shù)目的變化。

2 結(jié) 果

2.1 EMS患者腺上皮細胞鑒定 見圖1。培養(yǎng)原代EMS患者子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)最初幾天腺上皮細胞成團生長，呈鋪路石樣，后向周圍擴散，直至融合。通過腺上皮細胞和間葉細胞獨有的標志物廣譜角蛋白、波形蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)細胞pan-CK染色陽性，而VIMITEN染色陰性，說明培養(yǎng)出來的團塊狀細胞為子宮內(nèi)膜腺上皮細胞。

A：pan-CK染色陽性，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒(免疫組化染色，×400)；B：VIMITEN染色陰性，細胞質(zhì)及核內(nèi)均未見明顯的棕黃色顆粒(免疫組化染色，×400)；C：原代細胞培養(yǎng)第2天，細胞成團生長(免疫組化染色，×100)

2.2 兩組細胞OPN蛋白和mRNA表達比較 見表1。與未干預(yù)組比較，干預(yù)組腺上皮細胞OPN蛋白和mRNA表達明顯下降(均P<0.05)。

2.3 兩組細胞侵襲性比較 見圖2。與未干預(yù)組比較，干預(yù)組穿膜細胞數(shù)明顯降低(P<0.05)。

表1 兩組細胞OPN蛋白和mRNA表達比較

A、B：干預(yù)組(A)和未干預(yù)組(B)穿膜實驗結(jié)果(蘇木素染色，×200)；C：與未干預(yù)組比較，*P<0.05

3 討 論

EMS雖然是常見良性疾病，但有類似惡性腫瘤的黏附、轉(zhuǎn)移特點，是導(dǎo)致女性經(jīng)期疼痛、慢性盆腔痛、繼發(fā)性不孕等癥狀的重要原因[15-16]。目前EMS治療手段局限，術(shù)中全部病灶清除困難，術(shù)后仍有慢性盆腔痛，需要藥物鞏固治療。

OPN是1979年Senger等于骨基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的，研究[17]發(fā)現(xiàn)其與正常細胞的惡性變密切相關(guān)，其本質(zhì)是帶負電荷的鈣結(jié)合的分泌型磷酸化糖蛋白，組織結(jié)構(gòu)中富含精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列。OPN在人體胚胎、妊娠子宮蛻膜、腎和許多惡性腫瘤細胞等中有較高的表達[18]。腫瘤機制學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)OPN與惡性腫瘤的形成緊密相關(guān)。分子學(xué)研究[19]發(fā)現(xiàn)OPN通過與自身受體avβ3結(jié)合后激活依賴MAPK/PI3K通路的NF-κB通路，激發(fā)細胞中尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)和MMPs等相關(guān)因子的分泌，引導(dǎo)細胞侵襲過程、細胞胞質(zhì)中MMPs降解和重塑、細胞遷移及宿主免疫細胞逃逸和新生血管形成，發(fā)揮抑制細胞凋亡、促進腫瘤血管生成及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等作用，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。

目前已經(jīng)有學(xué)者通過實驗證實OPN在乳腺癌、胃癌以及婦科宮頸癌等惡性腫瘤中呈高表達，由此引發(fā)猜想，該因子是否與惡性腫瘤細胞于正常組織處黏附、侵襲及遠處轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性有關(guān)。許多研究發(fā)現(xiàn)OPN在EMS患者內(nèi)膜組織整個月經(jīng)周期中波動性表達，并且其表達明顯高于正常內(nèi)膜組織，于月經(jīng)周期分泌期的表達明顯高于增殖期，充分說明OPN是與孕卵著床密切相關(guān)的一種窗口期黏附因子，并受孕激素的調(diào)控，與該EMS的臨床藥物治療機制相吻合。本實驗組前期實驗[20]已經(jīng)證實以上說法。有研究通過誘導(dǎo)形成大鼠異位病灶，敲除OPN基因后發(fā)現(xiàn)大鼠EMS病灶明顯縮小，顯示OPN與EMS病灶大小、數(shù)目及體積密切相關(guān)。

本研究通過原代細胞培養(yǎng)，分離并培養(yǎng)出純度較高的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞，排除了間質(zhì)細胞的擾亂。經(jīng)過其獨有的角化蛋白、間質(zhì)細胞波形蛋白證實其為子宮內(nèi)膜腺上皮細胞。與未干預(yù)組比較，干預(yù)組腺上皮細胞OPN蛋白及mRNA表達均明顯下降，穿膜細胞數(shù)目明顯減少。由此我們得出，OPN可能是引起EMS的關(guān)鍵因子。結(jié)合既往研究分析， OPN與其受體結(jié)合后可能促進相關(guān)因子的釋放，進而介導(dǎo)了一系列的細胞反應(yīng)，導(dǎo)致EMS的發(fā)生。

綜上所述，OPN基因沉默后子宮內(nèi)膜腺上皮細胞OPN蛋白及mRNA表達下降，穿膜數(shù)量減少，侵襲性降低。本研究為臨床醫(yī)生從機制學(xué)出發(fā)對EMS進行有效靶向藥物干預(yù)、指導(dǎo)臨床用藥和術(shù)后隨訪提供了可靠的依據(jù)，擬于后期研究中進行質(zhì)粒導(dǎo)入聯(lián)合藥物干預(yù)增強OPN的表達，再次檢測細胞黏附能力及侵襲性的變化，以進一步證實我們的推測。本研究存在的不足之處為樣本量較少，原代細胞培養(yǎng)繁瑣，后期會加大樣本量，嘗試細胞傳代，以增加數(shù)據(jù)的可靠性。