尚嵩洋，王昱彤，楊術(shù)環(huán)，劉 全，張麗君，李 寧，杜學(xué)海，王大鵬，金雙勇，王 喆，張樹義*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110033）

遼育白牛是以夏洛萊牛為父本、遼寧本地黃牛為母本，經(jīng)40 余年的培育形成的特色肉牛品種，其全身被毛白色或草白色，具有體型大、增重快、肉質(zhì)好的特點。2010 年，遼育白牛獲得國家肉牛新品種認(rèn)定，是我國第3 個專門化肉牛品種。在品種育成初期，多數(shù)遼育白牛為有角牛，少數(shù)為無角牛（圖1）。在隨后的擴繁和推廣過程中無角遼育白牛逐漸受到青睞，但其無角性狀的形成機制尚不清楚。

圖1 無角和有角遼育白牛

以往研究牛無角性狀是由1 號染色體發(fā)生的顯性突變所致。Medugorac 等對夏洛萊牛、安格斯牛等多個品種無角牛進行了高通量測序，發(fā)現(xiàn)它們的1 號染色體都存在1 個或2 個拷貝212 bp 的插入片段（P），該片段替換掉了原位置的10 bp 序列導(dǎo)致了無角性狀的出現(xiàn)。荷斯坦牛的無角性狀則是由1 號染色體上的5 個突變位點（P、P、P、P和P）連鎖控制，該連鎖突變?yōu)楹伤固古Ｌ赜?。Medugorac 等發(fā)現(xiàn)土雷諾蒙古利亞牛的無角性狀是由1 號染色體的一段219 bp 的重復(fù)插入序列造成的（P）。對無角云嶺牛和夏南牛的研究顯示它們的無角性狀都是由于P位點的突變所致。為探究遼育白牛無角性狀的成因，研究對遼育白牛的P和P位點進行了檢測，對分型結(jié)果進行了統(tǒng)計分析，以期為遼育白牛無角新品系的選育工作提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究共采集遼育白牛血液及精液樣品304份（沈陽牧經(jīng)種牛繁育中心有限公司44 份、彰武長青牧業(yè)96 份、黑山綠源肉牛養(yǎng)殖場89 份、阜蒙福澤肉牛養(yǎng)殖有限公司43 份、喀左興泰肉牛養(yǎng)殖廠32 份），其中182 份為無角遼育白牛樣品，122 份為有角遼育白牛樣品；另采集無角夏洛來牛血液樣品4 份。精液樣品采用液氮保存，血液樣品-20℃保存。

1.2 試劑與儀器 血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司（北京）；精子基因組DNA 提取試劑盒，購自北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司（北京）；2×EasyTaq MasterMix 擴增酶，購自北京全式金生物。超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，NanoDrop 2000）；PCR 擴增儀（Applied Biosystems，ProFlex PCR systems）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，DYY-7C）；凝膠成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，ChampGel 5000plus）。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA 提取 根據(jù)試劑盒說明書提取樣本DNA，用1%瓊脂糖電泳檢驗DNA 條帶是否清晰明亮，使用超微量分光光度計檢測樣品OD 值和濃度。將合格樣品DNA 分裝保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 PCR 擴增反應(yīng) 研究以遼育白牛和夏洛萊?；蚪MDNA 為模板，采用文獻的引物擴增無角性狀位點P和P。P位點上游引物：5'-TCAAGAAG GCGGCACTATCT-3'，下游引物：5'-TGATAAACTGA CCCTCTGCCTATA-3'；P位點上游引物：5'-TGAAA CTTTTGGCAAGCATGA-3'，下游引物：5'-CTGTGTCT CCTCGTGAGTCC-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系15 μL，包括1 μL DNA 模板（20～100 ng/μL），7.5 μL 2×EasyTaq MasterMix擴增酶，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），4.5 μL 滅菌去離子水。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，56℃（P）或59℃（P）退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72℃延伸10 min，4℃保存。實驗使用擴增儀進行PCR 擴增。

1.3.3 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳及測序 PCR 產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶，使用1×50TAE 電泳緩沖液，電泳電壓100V，電泳40 min，在凝膠成像儀下拍照觀察電泳結(jié)果，判斷樣品分型。為驗證瓊脂糖電泳的分型結(jié)果，本研究在有角遼育白牛P和P位點的PCR 產(chǎn)物中，每個位點隨機抽取30 份進行測序；在無角遼育白牛P位點為雜合突變型的PCR 產(chǎn)物中隨機抽取30 份進行測序；2 個位點其余分型樣品的PCR 產(chǎn)物則均進行了測序。另外，采用文獻引物對8 頭P和P位點為純合無突變型的無角遼育白牛進行了連鎖突變位點（P、P、P、P和P）的分子鑒定。P、P、P和P位點采用PCR 產(chǎn)物測序，P位點采用克隆測序。委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，使用MEGA v 6.0 軟件讀取測序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

本研究應(yīng)用P和P位點對所采集的有角、無角遼育白牛和無角夏洛萊牛進行分子鑒定。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷樣品分型，結(jié)果見表1。P和P位點不同分型電泳條帶如圖2 所示。在182 頭無角遼育白牛中，7 頭為P位點純合突變型，其頻率為3.85%；164 頭為P位點雜合突變型，其頻率為90.11%；3 頭為P位點雜合突變型，其頻率為1.65%；其余8 頭則未攜帶P和P位點突變，對這8 頭牛進行了P、P、P、P和P位點的分子鑒定，結(jié)果顯示它們也未攜帶以上任意位點的突變。未發(fā)現(xiàn)同時攜帶P和P位點突變的無角遼育白牛。122 頭有角遼育白牛則均為P和P純合無突變型。4 頭無角夏洛萊牛則均為P位點雜合突變型。PCR 產(chǎn)物測序的結(jié)果與瓊脂糖電泳的分型結(jié)果一致。

圖2 遼育白牛P202ID 和P219ID 分型檢測結(jié)果

表1 遼育白牛P202ID 和P219ID 位點分型結(jié)果統(tǒng)計

3 討論

我國畜牧業(yè)轉(zhuǎn)型正處于關(guān)鍵時期，堅持自主創(chuàng)新、培育適應(yīng)市場需求的地方品種、提高畜禽種業(yè)經(jīng)濟效益是我國現(xiàn)代畜牧業(yè)的發(fā)展目標(biāo)。遼育白牛是歷經(jīng)40 余年自主培育的特色肉牛品種，其體型大、發(fā)育快、肉質(zhì)好，具有良好的市場基礎(chǔ)，高峰時期良種母牛數(shù)量曾達2 萬頭以上。但是，目前遼育白牛的飼養(yǎng)規(guī)模受到西門塔爾牛的嚴(yán)重沖擊，良種母牛數(shù)量和養(yǎng)殖規(guī)模都在不斷下降，如何提高遼育白牛市場競爭力，擴大飼養(yǎng)規(guī)模是遼育白牛繁育工作面臨的主要問題。近年來，由于無角遼育白牛具有不易爭斗、節(jié)省飼養(yǎng)空間、飼養(yǎng)安全性好等優(yōu)點，逐漸受到養(yǎng)殖戶歡迎。培育遼育白牛無角新品系有望提高其市場競爭力、擴大飼養(yǎng)規(guī)模。

研究通過牛無角位點P和P對182 頭無角和122 頭有角遼育白牛進行了分子鑒定，分型顯示在182 頭無角遼育白牛中，絕大多數(shù)（93.96%）都攜帶1個或2 個拷貝的P位點插入突變。另外檢測的4 頭無角夏洛萊牛同樣攜帶1 個拷貝的P位點插入突變，與Medugorac 等結(jié)果一致。結(jié)合遼育白牛的培育歷史，推測無角遼育白牛P位點的突變很可能源自夏洛萊牛。在3 頭無角遼育白牛中檢測到了P位點的插入突變。這一突變位點最早在土雷諾蒙古利亞牛中發(fā)現(xiàn)，在蜀宣花牛中也有檢測到，推測可能源自本地黃牛。研究表明，蒙古牛的無角性狀也是由P位點的突變所導(dǎo)致；另有8 頭無角遼育白牛則既未攜帶P和P位點突變，也未攜帶荷斯坦牛的無角連鎖突變。該結(jié)果可能存在其他未知基因或位點的突變導(dǎo)致這8 頭遼育白牛的無角性狀，其具體形成機制仍有待研究。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用P和P位點對182 頭無角遼育白牛進行了分子鑒定，其中171 頭（93.96%）攜帶P位點插入突變，3 頭（1.65%）攜帶P位點插入突變，其余8 頭（4.4%）則既未攜帶P和P位點突變，也未攜帶荷斯坦牛的無角連鎖突變，其成因仍有待深入研究。本研究的鑒定結(jié)果可為遼育白牛無角新品系的育種工作提供技術(shù)支持。