肖青青，何辰慶，徐士軍，陳軍軍，段夢琪，張 健，商 鵬*

（1.西藏農(nóng)牧學院動物科學學院，西藏林芝 860000；2.西藏特色農(nóng)牧資源研發(fā)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，西藏林芝 860000）

豬脂肪沉積既影響豬胴體品質也影響肉質風味。脂肪組織作為能量儲存和內(nèi)分泌器官，對機體能量穩(wěn)態(tài)起著重要作用，是動物體內(nèi)重要的組成部分，其分化與發(fā)育是一個復雜的過程，受多基因調控，脂肪的積累是由脂肪沉積和脂肪代謝之間的平衡關系所決定，同時，脂肪的含量與豬胴體品質、豬肉風味、嫩度、多汁性密切相關。目前，已鑒定出與豬脂肪代謝相關的基因有：生長激素（）、C1q 腫瘤壞死因子相關蛋白（）、脂聯(lián)素、瘦素、核受體亞家族4 A組成員3（）、載脂蛋白A1（）以及細胞分裂周期42（）等。

視黃醇結合蛋白（）是疏水小分子結合蛋白家族的一員，主要由肝臟合成，在維生素A 生理功能發(fā)揮時起著重要作用；同時，在胞內(nèi)協(xié)助視黃醇的轉運。而視黃醇結合蛋白5（）是視黃醇結合蛋白家族新的成員，主要分布于肝臟中，在視黃醇代謝中扮演著重要角色，其分子結構由10 條反向平行的鏈組成。Bahar 等研究證實基因在脂肪和肝臟組織中有一定的表達。

大約克夏豬經(jīng)過長期選擇形成了生長速度快、胴體性能好以及沉脂能力低等特點；藏豬是我國少有的高原小型地方品種豬，具有耐粗飼、耐寒、抗低氧以及沉脂能力強等特點。本實驗選取西藏林芝地區(qū)的藏豬和大約克夏豬為研究對象，利用實時熒光定量PCR 技術，探究基因在肝臟、腎臟以及腹脂中的相對表達量，通過單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）分析對基因3'側翼區(qū)、5' 側翼區(qū)和CDS 區(qū)進行SNPs 位點篩選，以期為研究豬基因調控脂肪代謝的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗以藏豬（TP）和大約克夏豬（YY）為研究對象，藏豬來源于西藏農(nóng)牧學院實習牧場，大約克夏豬來源于林芝市宇高生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司。采集藏豬（50 頭）和大約克夏豬（48 頭）耳組織，置于75%酒精中，-20℃保存，用于提取總DNA。選擇相同飼養(yǎng)方式且健康狀況良好的180 日齡藏豬和大約克夏豬（各8 頭）進行屠宰，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背脂、腹脂、腿肌和背最長肌各2 份樣品，立即放入RNA 保存液中，液氮速凍，再放置于-80℃保存，用于總RNA 提取。

1.2 主要試劑與儀器 RNA 保存液（購自北京百泰克生物技術有限公司）、2×Taq PCR Mix、FastKing（With gDNase）快速反轉錄試劑盒、SYBR Green 定量PCR試劑盒（購自北京天根生化科技有限公司）、PCR 擴增儀（購自北京奧秘佳得醫(yī)藥科技有限公司）、羅氏定量儀（購自上海土森視覺科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA、RNA 提取及cDNA 的制備 采用苯酚-氯仿法提取耳組織中的總DNA，Trizol 法提取各組織中的總RNA，RNase-Free ddHO 溶解，1% 瓊脂糖凝膠電泳法和Nano Drop 2000 超微量分光光度計檢測DNA（濃度范圍為900～1 000 ng/μL）、RNA 濃度（濃度范圍為1 200～1 400 ng/μL）和質量，DNA 于-20℃保存?zhèn)溆?，RNA 于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩DNA 的制備根據(jù)FastKing（With gDNase）快速反轉錄試劑盒說明書進行。

1.3.2 定量引物與DNA 引物設計與合成 從NCBI 網(wǎng)站上下載已經(jīng)公布的豬（Sus scrofa）基因的mRNA序列（登錄號：NM-00145223），使用Premier 5.0 軟件設計熒光定量PCR 擴增產(chǎn)物（表1），以（登錄號：XM_0031225183）、（登錄號：AY550069）基因為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RNase-Free ddHO 進行溶解，-20℃保存。

表1 定量PCR 引物序列

登錄GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank），下載基因（登錄號：NC_010447）DNA 序列。使用Premier 5.0 軟件設計、NCBI 網(wǎng)頁在線設計基因3'側翼區(qū)、5'側翼區(qū)和CDS 區(qū)的特異性引物（表2 為部分引物序列），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，RNase-Free ddHO 溶解，-20℃保存。

表2 篩選SNPs 的引物序列

1.3.3 半定量及熒光定量PCR 采用所反轉的9 個組織cDNA 進行半定量，其程序為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，40 個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析RBP5、基因在豬不同組織中的表達情況。

采用SYBR Green 定量PCR 試劑盒在實時熒光定量PCR 儀進行擴增。根據(jù)半定量結果，選擇表達量較高組織的cDNA 樣品進行定量PCR，每個樣品設3個重復并設置標準樣和空白樣，反應體系為20 μL：Mix 10 μL，RNase-Free ddHO 8 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 模板（濃度范圍為1 200～13 000 ng/μL）為1 μL；熒光定量程序為：95℃預變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35 個循環(huán)。樣品目的基因的表達量采用2法計算：

ΔC=C-C

ΔC=C-C

ΔΔC=ΔC-ΔC

目的基因表達量=2

1.3.4 普通PCR 擴增 以提取的DNA 為模板進行普通PCR 擴增。PCR 擴增體系為20 μL：2×PCR HeroMix（dye）10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，RNase-free ddHO 8 μL，DNA 模板1 μL。

PCR 反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸50 s，共36 個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。將PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，合格產(chǎn)物送至成都生物工程股份有限公司進行測序。

1.3.5 基因型頻率與基因頻率 以提取的藏豬和大約克夏豬DNA 為模板，采用混池測序進行基因多態(tài)性分析，藏豬和大約克夏豬各10 頭，用Chromas Pro軟件進行序列對比分析，篩選SNPs 位點后，針對有效篩選出的位點擴大樣本進行單個個體測序，由成都生物工程股份有限公司進行測序。根據(jù)測序結果統(tǒng)計基因頻率和基因型頻率。

1.3.6 統(tǒng)計分析 對個體測序結果使用Excel 軟件計算各突變位點的基因頻率和基因型頻率，使用SigmaPlot 10 制備圖表，使用SPSS 22.0 軟件對基因型分布和基因型頻率進行檢驗，結果以“平均數(shù)±標準誤”表示，<0.01 表示差異極顯著，<0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1基因半定量結果與不同組織中的相對表達量由圖1、圖2 可知，、基因在不同組織中表達有差異，基因中，腎臟表達量最高，其次為肝臟、脾臟和腹脂，在肺臟和背脂中的表達相對較低。

圖1 RBP5 基因在不同組織中的表達情況

圖2 內(nèi)參β-actin 在不同組織中的表達情況

使用熒光定量PCR 技術檢測藏豬和大約克夏豬肝臟、腎臟和腹脂中基因的表達水平，結果顯示：在肝臟、腎臟和腹脂這3 個組織中，藏豬和大約克夏豬的基因表達量趨勢一致，均為腎臟中的表達量最高，其次為肝臟，腹脂中的表達量最低；在腎臟和肝臟中，藏豬的表達量極顯著低于大約克夏豬，在腹脂中，藏豬的表達量顯著低于大約克夏豬（圖3）。

圖3 RBP5 基因在腹脂、肝臟、腎臟中mRNA 相對表達量

2.2 普通PCR 擴增結果 普通PCR 擴增結果用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增的PCR 條帶清晰明亮，條帶長度約為899 bp，與預期目的條帶大小一致（圖4），另2 對引物經(jīng)混池測序，無突變位點。

圖4 RBP5 基因目的片段擴增凝膠電泳結果

2.3基因型頻率與等位基因頻率分布分析 利用ChromasPro 軟件對個體測序結果和原序列對比（圖5），發(fā)現(xiàn)基因在3'側翼區(qū)有3 個突變位點，分別為'GA、'TC、'CT，將這3 個位點的基因型頻率以及等位基因頻率通過卡方檢驗（表3），證實這3個突變位點均符合哈迪-溫伯格定律。

表3 RBP5 基因多態(tài)性位點基因型頻率和等位基因頻率

圖5 RBP5 基因突變位點測序峰圖

3 討論

機體中的脂肪一部分被消化吸收，另一部分被消化后進入肝臟，轉變?yōu)轶w脂而貯存。當機體饑餓時，貯存在體內(nèi)的體脂可先被運送到肝臟，進行分解利用。肝臟是體內(nèi)脂肪酸、膽固醇、磷酯合成的主要器官之一，而脂肪肝就是在脂肪代謝紊亂時，脂肪堆積于肝臟內(nèi)而形成的疾病。付言峰等人研究發(fā)現(xiàn)，腎臟中相對不易發(fā)生脂肪沉積，由本實驗結果推測基因在腎臟中的高表達促進了脂肪代謝，導致脂肪沉積能力較弱。陳究成等通過對嵊縣花豬全基因組測序，進行功能選擇信號檢測，篩選出候選基因，證明基因在脂肪代謝通路中發(fā)揮重要的作用。在本研究中發(fā)現(xiàn)，藏豬和大約克夏豬的基因在腎臟、肝臟中的表達量都高于脂肪組織，推測基因高表達可能會促進脂肪的代謝，以保護肝臟和腎臟的正常功能，也是造成藏豬和大約克夏豬脂肪沉積能力差異的原因之一。公維華也認為RBP5 與脂肪細胞的分化和發(fā)育有關，其在多個不同群體的豬中進行RBPs 家族基因SNPs 研究中發(fā)現(xiàn)，基因在脂肪組織中表達量很低，與本研究結果一致。在本研究的半定量結果中也發(fā)現(xiàn)基因mRNA 相對表達量在腹脂中表達量最低，推測這可能是造成豬的腹脂含量較高的原因之一。本研究選用180 日齡藏豬和大約克夏豬為研究對象，6～12 月齡是豬脂肪發(fā)育的高峰期，此時豬的腹脂組織中基因表達量幾乎到最低，本實驗結果符合豬的生長發(fā)育規(guī)律。

本實驗在豬基因的3'側翼區(qū)發(fā)現(xiàn)3 個SNPs位點，分別為'G274A、'T278C、'C346T，且這3 個位點的基因頻率和基因型頻率在藏豬與大約克夏豬中存在極顯著差異。由多態(tài)性位點和實時熒光定量PCR 結果可知，這3 個位點的多態(tài)性結果與實時熒光定量PCR結果差異顯著性趨勢一致，由此推測，豬基因的3 個位點可能是調控豬脂肪代謝的關鍵功能位點，但具體調控機制還需進一步研究。

4 結論

本研究通過實時熒光定量PCR 和SNPs 位點篩選發(fā)現(xiàn)，基因在腎臟組織中表達量高，3'側翼區(qū)發(fā)現(xiàn)'G274A、'T278C、'C346T 3 個突變位點，推測這3個突變位點可能是調控基因表達的關鍵功能位點。本研究結果為基因在脂肪代謝調控機制方面的后續(xù)研究提供了可靠依據(jù)。