林建胡， 林文雄

(1.莆田學(xué)院 教務(wù)處， 福建 莆田 351100； 2.福建農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所， 福州 350002)

0 引言

研發(fā)環(huán)境友好型的殺蟲劑對保護生態(tài)環(huán)境和人類健康具有重要意義.煙堿(nicotine)是煙草中含量最高的生物堿[1]，它能通過與乙酰膽堿受體結(jié)合而阻斷昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)信號的正常傳導(dǎo)，進而導(dǎo)致昆蟲活動減少和無法覓食[2-4].除此，煙堿還可以起到殺卵的作用，特別是對軟體幼蟲以及蚜蟲的防治具有較好的效果[5-6]：因此，煙堿目前已被作為廣譜殺蟲劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[7].相比其他新型煙堿類農(nóng)藥[8]，煙堿易被光和空氣氧化而失去抗蟲活性[9]，因此制備煙堿類殺蟲劑時，既需要考慮其藥效時長，又要考慮其對人體的毒副作用及對環(huán)境的影響.目前，國內(nèi)外開發(fā)應(yīng)用的煙堿農(nóng)藥主要有乳油、水劑、微乳、微囊、納米粒和納米脂質(zhì)藥物偶聯(lián)物[10]等制劑，但是這些制劑在制備[3]或使用過程[4，11]中會影響生態(tài)；因此，需要開發(fā)一種對環(huán)境友好的新型煙堿制劑.

由于固體脂質(zhì)納米粒具有易于制備、成本低、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，因此常用來替代脂質(zhì)體、微乳和聚合物納米粒[12-13].鑒于此，本文利用高壓勻質(zhì)法[14]制備了一種煙堿固體脂質(zhì)納米粒(nicotine loaded solid lipid nanoparticles, N-SLN)，并篩選出最優(yōu)處方和最佳工藝.

1 實驗材料與方法

1.1 材料

儀器： 1700型紫外可見分光光度計(日本島津有限公司)； Nano ZS納米粒徑電位分析儀、Mastersizer 2000激光粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)； Moticam 3.0 MP顯微鏡(廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)； Micron LAB 40高壓勻質(zhì)機(德國APV公司)；差式掃描量熱儀(上海梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司); L-60型超速離心機(美國貝克曼庫爾特公司).

試劑：三肉豆蔻酸甘油酯Dynasan?114、三硬脂酸甘油酯Dynasan?118 (上海帝科精細化工有限公司)；氫化葵花籽油(法國Société Industrielle des Oléagineux公司)； 煙堿(98%，德國Alfa Aesar公司)； PVA30000/PVA60000/PVA125000(美國Sigma-Aldrich公司)；Tween?20/Tween?60/Tween?80 (上海阿拉丁試劑有限公司)； Poloxamer 188/Poloxamer 407(德國Alfa Aesar公司)； PVP K25/PVP K30(連云港榮禾新)；Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9.0，北京諾博萊德科技有限公司)；鋁制坩堝(上海笛柏實驗設(shè)備有限公司).

1.2 脂質(zhì)材料對煙堿溶解性的考察

稱取等量的三肉豆蔻酸甘油酯(Dynasan?114)、三硬脂酸甘油酯(Dynasan?118)和氫化葵花籽油(hydrogenated sunflower oil，HSO)分裝在玻璃瓶中，然后將玻璃瓶加熱至80 ℃；待脂質(zhì)熔融后分別向玻璃瓶中滴加質(zhì)量分數(shù)為7%、10%和20%的煙堿，并輕晃玻璃瓶使之溶解.常溫下滾動瓶壁，使液體在玻璃瓶壁上凝固成均勻的薄層.通過肉眼觀察篩選出能融合煙堿的脂質(zhì)，備用.在篩選出的熔融脂質(zhì)中繼續(xù)滴加質(zhì)量分數(shù)為25%和50%的煙堿，且在脂質(zhì)未凝固前將其滴加到載玻片上，用顯微鏡觀察脂質(zhì)凝固后的形態(tài).當脂質(zhì)凝固在瓶壁時，利用差式掃描量熱法(differential scanning calorimetier， DSC)測定煙堿在脂質(zhì)中的最大包封量.稱取含有2 mg煙堿的凝固脂質(zhì)置于鋁制坩堝中進行DSC分析.DSC分析時，以空的鋁制坩堝為參比，氮氣(99%)為保護氣，溫度設(shè)定程序為25 ℃→-140 ℃(停留10 min)→ 95 ℃(停留10 min)→ 20 ℃，升溫(降溫)速率為10 ℃/min.

1.3 乳化劑的篩選

利用高壓勻質(zhì)法制備N-SLN，處方為脂質(zhì)材料8.5%(3.4 g)、煙堿1.5%(0.6 g)、乳化劑2.0%(0.8 g)和加至40 g的0.01 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9.0).N-SLN的制備流程如圖1所示.在緩沖液中加入0.8 g的乳化劑，攪拌均勻后水浴加熱至80 ℃(形成水相).將0.6 g的煙堿滴入80 ℃的脂質(zhì)中(形成油相).將油相緩慢加入到水相中后立刻使用高剪切分散乳化機(上海壹維機電設(shè)備有限公司，SAII-2)在8 000 r/min速度下持續(xù)剪切1 min，然后將混合物轉(zhuǎn)移至85 ℃的高壓勻質(zhì)機中循環(huán)(壓力為600 bar)；將所得產(chǎn)物倒入80 ℃的玻璃瓶中，冷卻至室溫后即得N-SLN.取制備的N-SLN 10 μL，用5 mL超純水(Dura 12型，美國澤拉布有限公司)稀釋，然后利用納米粒度儀(光子相關(guān)光譜法，photon correlation spectroscopy， PCS)和激光粒度儀測定N-SLN的平均粒徑和粒徑分布情況[15].

圖1 N-SLN的制備流程

1.4 穩(wěn)定性的考察

將篩選出的乳化劑處方按1.3中的制備方法分別高壓循環(huán)1、 3、 5、 7、 10次，然后將其分別在室溫下放置1、 7、 30 d.按1.3中的方法考察上述N-SLN的平均粒徑和粒徑的分布情況，同時利用顯微鏡觀察是否有大顆粒存在.選擇出最優(yōu)處方后，利用Nano ZS納米粒徑電位分析儀對最優(yōu)處方下制備的N-SLN進行電位測定.

1.5 包封率的測定

將不加煙堿的空白固體脂質(zhì)納米粒用甲醇破乳后，用0.01 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液將其稀釋，然后利用紫外-可見光分光光度計在200～800 nm范圍內(nèi)對其進行掃描；對比所得的掃描峰與煙堿的掃描峰，以此確定煙堿的最大吸收峰.稱取40 mg煙堿置于100 mL的容量瓶中作為標準儲備液(400 μg/mL).分別量取該溶液30、40、60、80、100 μL置于10 mL容量瓶中，用Na2CO3-NaHCO3緩沖液定容后得到系列質(zhì)量濃度分別為12、16、24、32、40 μg/mL的標準液，然后用吸光度A對質(zhì)量濃度C(μg/mL)做標準曲線.移取5 mL在最優(yōu)處方下制備的N-SLN，室溫下超速(120 000×g)離心5 h； 溶液過50 nm的濾膜，續(xù)濾液用緩沖液稀釋后用紫外分光光度計測定煙堿的吸光度；將吸光度代入標準曲線得到游離藥物的濃度(Cfree)， 并將其作為未包封的量.另取N-SLN 5 mL， 用甲醇超聲10 min(破乳)后將其定容至50 mL； 溶液過50 nm濾膜，續(xù)濾液用超純水稀釋后測定煙堿的吸光度.根據(jù)吸光度計算出藥物的總濃度(Ctotal)， 并將其作為藥物的總濃度.包封率(EE)的計算公式為：

EE=(Ctotal-Cfree)/Ctotal×100%.

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 脂質(zhì)材料對煙堿溶解性的考察

研究表明，對藥物溶解性高的脂質(zhì)材料通常具有較高的載藥能力[16].由圖2可以看出，三肉豆蔻酸甘油酯或三硬脂酸甘油酯與煙堿融合凝固后，其表層有淡黃色的滲出物(黑色虛線內(nèi))，這表明二者均無法溶解質(zhì)量分數(shù)大于7%的煙堿.而當質(zhì)量分數(shù)為7%、10%和20%的煙堿融入HSO后，其凝固層為純白色，表明HSO對煙堿的溶解度高于三肉豆蔻酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯，因此本文將HSO作為N-SLN的脂質(zhì)材料.

圖2 不同質(zhì)量分數(shù)的煙堿對不同脂質(zhì)外觀的影響

在HSO中繼續(xù)滴加質(zhì)量分數(shù)為25%的煙堿時，HSO的外觀與滴加質(zhì)量分數(shù)為20%的煙堿時無明顯差異(圖3 A)，但當?shù)稳胭|(zhì)量分數(shù)為50%的煙堿時，可明顯觀察到全部脂質(zhì)被滲出的黃色物質(zhì)覆蓋(推測黃色物質(zhì)是超過包封能力的煙堿).由圖3B可以看出：在顯微鏡下，當?shù)渭訜焿A的質(zhì)量分數(shù)為0%～25%時，HSO為均勻的晶態(tài)；而滴加煙堿的質(zhì)量分數(shù)為50%時，HSO為液滴態(tài)(推測該液滴是超過包封能力的煙堿).圖4是HSO包封質(zhì)量分數(shù)為20%、25%、50%煙堿后的DSC曲線.由圖4可知，上述推測是正確的.

圖3 不同煙堿量在HSO中的包封能力(A為外觀圖，B為顯微觀察(×600))

圖4 HSO包封不同量煙堿后的DSC曲線

由圖4還可以看出，煙堿在-83 ℃左右有1個放熱峰.當質(zhì)量分數(shù)為20%和25%的煙堿加入到HSO后，位于-83 ℃左右的放熱峰消失，說明質(zhì)量分數(shù)為20%和25%的煙堿均可成功包封于HSO中.而當煙堿的質(zhì)量分數(shù)增加到50%時，在-83 ℃左右又出現(xiàn)了放熱峰，說明HSO無法包封質(zhì)量分數(shù)為50%的煙堿.另外，脂質(zhì)材料的熔融溫度隨煙堿質(zhì)量分數(shù)的增加出現(xiàn)了下降的趨勢，如包封煙堿的質(zhì)量分數(shù)為20%、25%、50%時，其熔融溫度分別為67 ℃、64 ℃、59 ℃.這種溫度變化說明,加入煙堿會使脂質(zhì)內(nèi)部的結(jié)構(gòu)趨于無序[16].

2.2 乳化劑的篩選

研究[15]顯示，固體脂質(zhì)納米粒易于出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象，進而影響溶液的穩(wěn)定性.本文實驗發(fā)現(xiàn)，用超純水取代緩沖液制備N-SLN仍會出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象,因此本文以粒徑的大小和均一性為指標，通過篩選乳化劑來延緩膠凝.在初步篩選乳化劑的過程中發(fā)現(xiàn)：由Tween?20、60、80制備的固體脂質(zhì)納米粒在制備當天(室溫下)就發(fā)生了膠凝現(xiàn)象;由Poloxamer 188制備的固體脂質(zhì)納米粒放置1 d (室溫下)后出現(xiàn)了膠凝現(xiàn)象;由Poloxamer 407、PVP K25、 PVP K30制備的固體脂質(zhì)納米粒在放置9 d (室溫下)后出現(xiàn)了膠凝現(xiàn)象.以上表面活性劑使N-SLN在短期內(nèi)就出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象的原因可能是這些表面活性劑的穩(wěn)定性較低，難以穩(wěn)定由煙堿、HSO和Na2CO3-NaHCO3緩沖液(0.01 mol/L)形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[17].在30 d內(nèi)未出現(xiàn)膠凝現(xiàn)象的有PVA 30000、PVA 61000和PVA 125000， 其原因可能是PVA在晶體表面具有較強的吸附能力，且其長鏈可阻礙微粒的相互接近，因此可有效阻礙膠凝現(xiàn)象的發(fā)生[15].

將PVA系列乳化劑分別進行1、3、5、7、10次高壓勻質(zhì)循環(huán)，并考察制備當天和7 d后的粒徑變化.由圖5可知， PVA 125000循環(huán)3次時，N-SLN的PCS平均粒徑和50%顆粒的粒徑分布上限 [d(v)50%] 均在500 nm左右， 99%顆粒的粒徑分布上限 [d(v)99%] 均大于1 μm，且多分散指數(shù)(PDI)在0.3附近.這說明循環(huán)3次的固體脂質(zhì)納米粒雖然粒徑較為均一，但仍有1%左右的大顆粒.PVA 30000循環(huán)3次時， N-SLN的PCS平均粒徑和d(v)50%均在200 nm左右，但d(v)99%大于4 μm.這說明PVA 30000作為乳化劑時得到的納米顆粒粒徑雖然大部分在200 nm左右，但仍存在小部分的大顆粒.產(chǎn)生大顆粒的原因可能是由Ostwald熟化作用導(dǎo)致N-SLN的混懸液不穩(wěn)定造成的[15].PVA 61000循環(huán)7次和10次時， N-SLN的PCS平均粒徑均小于500 nm，d(v)99%均小于1 μm， 且PDI在0.2附近，這說明由PVA 61000制備的N-SLN粒徑大小均一、穩(wěn)定.其原因可能與PVA的性質(zhì)(分子量越大,穩(wěn)定性越強，親水性越弱)有關(guān)[18].基于上述結(jié)果，本文將PVA 61000作為制備N-SLN的考察對象.

圖5 不同PVA系列乳化劑對煙堿固體脂質(zhì)納米粒粒徑的影響

2.3 穩(wěn)定性的考察

圖6為以最優(yōu)處方制備的N-SLN在放置30 d時的粒徑變化.由圖6A可知，乳化劑PVA 61000分別循環(huán)7次和10次時所制備的N-SLN在30 d內(nèi)其d(v)99%均小于1 μm，即所制備的N-SLN在30 d內(nèi)(室溫下)其粒徑仍可保持在納米級別.其中循環(huán)7次的N-SLN的PCS平均粒徑、d(v)50%和d(v)99%在制備當天的數(shù)據(jù)與30 d后的數(shù)據(jù)相近，且PDI的變化也較小(由0.227變?yōu)?.264);循環(huán)10次的N-SLN雖然其d(v)50%和d(v)99%在制備當天的數(shù)據(jù)與30 d后的數(shù)據(jù)也相近，但PCS平均粒徑在30 d后增加了約100 nm， PDI也由0.220變?yōu)?.318.循環(huán)10次制備的N-SLN的粒徑變化相對較大的原因可能是循環(huán)次數(shù)越多，制劑獲得的能量越多，進而更容易導(dǎo)致顆粒聚集[19].圖6 B進一步證實了上述結(jié)果.

由于煙堿(pKa=8.02)在pH 9.0的緩沖液中會以去質(zhì)子態(tài)存在(易溶于脂質(zhì))[20]，所以本文選用pH 9.0的Na2CO3-NaHCO3緩沖液(0.01 mol/L)來增加煙堿的包封率.通常脂質(zhì)在處方中的質(zhì)量比一般小于10%(大于10%會影響粒徑的穩(wěn)定性)，考慮到比例過小會影響載藥效果，故本實驗在前期預(yù)實驗基礎(chǔ)上將脂質(zhì)的比例確定為8.5%.對在最優(yōu)處方(PVA 61000 2.0%、煙堿1.5%、HSO 8.5%、 88%的Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9.0))和最佳工藝(600 bar、 85 ℃的高壓勻質(zhì)機中循環(huán)7次)下制備的N-SLN進行電位測定顯示，該N-SLN在溶液中的zeta電位為-33.2 mV.由于zeta電位絕對值大于30 mV即可證明其穩(wěn)定性[21]，由此可推測在該最優(yōu)處方下制備的N-SLN可保持長久的穩(wěn)定性.

圖6 N-SLN 30 d后的粒徑穩(wěn)定性(A為循環(huán)次數(shù)對粒徑的影響；B為顯微觀察(×600))

2.4 包封率的測定

為了測定煙堿在最優(yōu)處方中的包封率，對煙堿緩沖液和空白固體脂質(zhì)納米粒的紫外掃描圖(圖7 A)進行對比分析.由圖7 A可知， 261 nm可作為檢測煙堿的最大吸收峰，且在該波長下空白固體脂質(zhì)納米粒不會對煙堿的測定產(chǎn)生影響．以煙堿標準液的質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(x)、吸光度A為縱坐標(y)作圖，由此得煙堿的標準曲線回歸方程：y=0.020 2x-0.002 2，R2=0.999 7， 如圖7 B所示.由圖可以看出，在12～40 μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系.根據(jù)公式(1)計算得最優(yōu)處方的包封率為(12.3±4.2)%.

圖7 煙堿溶液的最大吸收峰(A)和標準曲線(B)

3 結(jié)論

研究表明：N-SLN的最優(yōu)處方為1.5%的煙堿、 2.0%的PVA 61000、 8.5%的HSO和88.0%的Na2CO3-NaHCO3緩沖液(pH 9.0).制備N-SLN的最佳工藝為利用高壓勻質(zhì)機在600 bar壓力、 85 ℃條件下循環(huán)7次.在最優(yōu)處方和最佳工藝下制備的N-SLN可在30 d內(nèi)保持穩(wěn)定.本文研究結(jié)果可為開發(fā)環(huán)境友好型農(nóng)藥新制劑提供良好參考.在本文的研究中，煙堿的載藥量還有待進一步提高，今后我們將通過篩選更多的固體脂質(zhì)來提高N-SLN的載藥量.