陳穎穎，唐 翀

（南通大學第二附屬醫(yī)院/南通市第一人民醫(yī)院1呼吸內(nèi)科；2普外科，江蘇 226001）

肺癌是常見的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，2018年全球約有177萬肺癌患者死亡[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的80%[2]，目前治療包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療[3]，但大多數(shù)患者診斷時已處于中晚期，5年生存率低于20%[4]。因此，尋找新的生物標志物和治療靶點尤為重要。

MicroRNA（miRNA）是一段內(nèi)源性非編碼單鏈RNA小分子，通過與靶基因3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）完全或不完全互補結(jié)合而降解靶基因mRNA，調(diào)控靶基因水平，進而影響細胞生物學過程[5]。一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因，一個基因也可以被多個miRNA調(diào)控，預測超過60%的人類基因受miRNAs調(diào)控。miRNA在多種腫瘤中差異表達，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與NSCLC的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，miR-320a在NSCLC中表達下調(diào)，并可作為直接靶向NSCLC細胞的腫瘤抑制因子[7-8]。泛素連接酶Pirh2（p53-induced RING-H2 protein）是一種具有內(nèi)在泛素連接酶活性，促使底物蛋白發(fā)生泛素化修飾的結(jié)合蛋白，影響NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學過程[9-10]。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Pirh2可能是miR-320a靶基因，但miR-320a是否靶向調(diào)控NSCLC中Pirh2蛋白，從而參與細胞增殖、侵襲和遷移仍不清楚。本研究選擇2020年1月—12月于我院行NSCLC根治手術(shù)的20對癌組織和癌旁組織標本以及人NSCLC細胞系，旨在探究miR-320a靶向Pirh2對NSCLC細胞增殖和遷移的調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 組織標本 NSCLC根治手術(shù)的20對癌組織及癌旁組織標本，均經(jīng)病理學檢查確認，在手術(shù)后立即儲存在液氮中。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 人NSCLC細胞系 人NSCLC細胞系（H1299、A549、SPCA1、H460、Calu1）和正常支氣管上皮細胞株（16HBE）購自美國ATCC公司，采用含10%胎牛血清，鏈霉素（50μg/mL）和青霉素（50 U/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基，于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 待A549細胞生長至80%融合度，以適當密度接種至6孔板中。按轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為6組:NC mimics組、miR-320a mimics組、NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-Pirh2組（轉(zhuǎn)染si-Pirh2）、miR-320a mimics+NC組（共轉(zhuǎn)染miR-320amimics和pcDNA3.1）、miR-320a mimics+Pirh2組（共轉(zhuǎn)染miR-320a mimics和pcDNA3.1-Pirh2）。按照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明進行轉(zhuǎn)染，48 h后采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果，蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）測定Pirh2蛋白表達情況。

1.4 熒光實時定量PCR 采用Trizol（Invitrogen公司）提取細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄cDNA，TaqMan MicroRNA試劑盒檢測miR-320a表達水平，以U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCt進行定量。實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測Pirh2蛋白表達 提取轉(zhuǎn)染細胞總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)沸水浴變性后，取20μg蛋白上樣至12%SDS-PAGE凝膠電泳。電壓80 V，當Marker跑至分離膠與濃縮膠交界處，換至120 V電壓。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜置于含5%脫脂牛奶中室溫下封閉2 h，TBST洗膜，加入一抗，置于4℃冰箱過夜。洗膜，5 min×3次，加入二抗，室溫避光孵育2 h，洗膜，5 min×3次。顯影。

1.6 CCK-8細胞增殖試驗 96孔板中加入100μL細胞懸液，在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h。向培養(yǎng)板加入10μL不同轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的A549細胞，孵育24 h、48 h、72 h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，采用酶標儀檢測各組細胞在490 nm波長處的吸光度值。實驗重復3次，取均值。

1.7 克隆形成實驗 將轉(zhuǎn)染的NSCLC細胞以合適密度接種在6孔板中，培養(yǎng)2～3周。PBS洗滌2次，多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色，計數(shù)大于2 mm的克隆數(shù)目。

1.8 Transwell實驗 遷移實驗:待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細胞，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，將104個細胞加到Transwell上室，下室加入600～800μL DMEM培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去上室中培養(yǎng)基，加入甲醇室溫固定30 min。吸干固定液，加入染液染色15～30 min。清水沖洗浸泡數(shù)次，吸去上室液體，棉簽擦除未穿過的細胞，中性樹膠封片。顯微鏡下隨機選取9個視野觀察，計算穿膜細胞數(shù)。侵襲實驗:按1∶2比例將基質(zhì)膠與無血清DMEM培養(yǎng)基混勻，包被Transwell上室，將104個細胞加入Transwell上室，其余操作同遷移實驗。

1.9 熒光素酶報告基因?qū)嶒?將A549細胞接種于24孔板，使用Lipofectamine 2000將構(gòu)建好的野生型Pirh2-3′-UTR-WT和突變型Pirh2-3′-UTRMUT的熒光素酶報告質(zhì)粒及NC mimics、miR-320a mimics轉(zhuǎn)染至A549細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作步驟檢測各組細胞熒光素酶活性。實驗重復3次，取均值。

1.10 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，組間差異性比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 人NSCLC癌組織和細胞株中miRNA-320a表達水平下調(diào) 熒光實時定量PCR檢測顯示，與癌旁組織相比，20例人NSCLC癌組織中miR-320a表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖1A）。與正常支氣管上皮細胞株16HBE相比，NSCLC細胞株H1299、A549、SPCA1、H460、Calu1中miR-320a表達顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），其中A549細胞表達最低，因此在后續(xù)實驗中作為細胞模型（圖1B）。

圖1 人NSCLC組織和細胞株miRNA-320a表達水平

2.2 miR-320a過表達抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲 將miR-320a mimics和NC mimics轉(zhuǎn)染到A549細胞中，qRT-PCR測定顯示，與NC mimics轉(zhuǎn)染細胞相比，miR-320a mimics轉(zhuǎn)染細胞中miR-320a表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖2A）。CCK-8試驗表明，與NC mimics轉(zhuǎn)染細胞相比，miR-320a mimics轉(zhuǎn)染細胞增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或＜0.01）（圖2B）。細胞遷移實驗表明，miR-320a mimics轉(zhuǎn)染細胞穿過小室基底膜的數(shù)目明顯少于NC mimics轉(zhuǎn)染細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2C）。細胞侵襲實驗的結(jié)果類似（圖2D）。

圖2 A549細胞增殖、遷移和侵襲實驗

2.3 miR-320a靶向調(diào)控Pirh2表達 TargetScan生物信息學軟件預測顯示，miR-320a與Pirh2 3'UTR存在結(jié)合位點（圖3A），推測Pirh2可能是miR-320a的靶基因。熒光素酶報告實驗顯示，miR-320a mimics顯著降低WT-Pirh2 3′UTR的熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3B），而對MUT1和MUT2 Pirh2 3′UTR熒光素酶活性無影響，提示miRNA-320a與Pirh2 3′UTR特異性結(jié)合，直接調(diào)控Pirh2表達。Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-320a mimics組細胞中Pirh2蛋白表達水平低于miRNA-NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3C），進一步證實miR-320a負向調(diào)控Pirh2表達。

圖3 熒光素酶活性實驗

2.4 Pirh2低表達抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲 將siPirh2#1、siPirh2#2、siPirh2#3和siRNA NC分別轉(zhuǎn)染到A549細胞中，Western blot顯示siPirh2#2基因干擾效果最好（圖4A，見封二），因此后續(xù)實驗選擇siPirh2#2沉默細胞中Pirh2表達?？寺⌒纬蓪嶒灡砻鳎c轉(zhuǎn)染siRNA NC細胞相比，轉(zhuǎn)染siPirh2#2的A549細胞增殖能力明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4B，見封二）。細胞遷移實驗表明，轉(zhuǎn)染siPirh2#2的細胞穿過小室基底膜的數(shù)目明顯少于轉(zhuǎn)染siRNA NC的細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4C，見封二）。侵襲實驗的結(jié)果類似（圖4D，見封二）。

圖4 Pirh2低表達抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲

2.5 miRNA-320a負調(diào)控Pirh2對NSCLC細胞增殖和遷移能力的影響 將miR-320a mimics+pcDNA3.1和miR-320a mimics+pcDNA3.1-Pirh2分別轉(zhuǎn)染到A549細胞中，克隆形成實驗和遷移實驗表明，與miR-320a mimics+pcDNA3.1轉(zhuǎn)染細胞相比，miR-320a mimics+pcDNA3.1-Pirh2轉(zhuǎn)染的A549細胞增殖能力增強（圖5A，見封二），細胞穿過小室基底膜的數(shù)目明顯增多（圖5B，見封二），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），侵襲實驗也發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象（圖5C，見封二）。

圖5 miRNA-320a負調(diào)控Pirh2對NSCLC細胞增殖和遷移能力的影響

3 討 論

NSCLC惡性程度較高，容易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者確診時已處于晚期，目前的治療方法雖然在一定程度上可減緩病情發(fā)展，但如何延長患者的生存期仍需進一步研究[11-12]。先前研究已證明miRNA可能是癌癥過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13-14]，了解NSCLC與miRNA異常表達之間的關(guān)系有助于尋找新的治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)miR-320a在人NSCLC組織和細胞株中表達下調(diào)，證實miR-320a對NSCLC細胞增殖和侵襲的抑制作用以及NSCLC細胞中miR-320a負調(diào)控Pirh2的表達。

有文獻報道m(xù)iR-320a是多種腫瘤的抑制因子，與NSCLC關(guān)系密切。miR-320a通過靶向電壓依賴性陰離子通道蛋白1（VDAC1）影響NSCLC細胞的增殖和侵襲[15]；miR-320a在NSCLC組織中表達下調(diào)，并通過直接靶向胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）抑制腫瘤細胞的生長和侵襲[16]；miR-320a-3p/ELF3軸通過PI3K/Akt途徑調(diào)控NSCLC細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[7]。這些文獻均表明miR-320a對靶基因的調(diào)控在NSCLC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究通過靶基因預測軟件檢測發(fā)現(xiàn)miR-320a與Pirh2 3′-UTR存在互補的核苷酸序列，推測Pirh2可能是miR-320a的潛在靶基因，miR-320a可能通過靶向Pirh2參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。

Pirh2最早由GRINDEL等[17]發(fā)現(xiàn)，由261個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為30 kDa，其中包含Rirh-H2結(jié)構(gòu)域，是RING結(jié)構(gòu)域家族的泛素連接酶E3，具有內(nèi)在泛素連接酶活性，促使底物蛋白發(fā)生泛素化修飾[9]。有研究報道，Pirh2促進p53發(fā)生泛素化而降解，使p53抑制腫瘤生長的功能減弱或消失，導致腫瘤惡化。有研究發(fā)現(xiàn)，Pirh2促進NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲，且與患者低生存率有關(guān)[10]。關(guān)于miR-320a是否通過調(diào)控Pirh2而進一步影響NSCLC細胞的增殖和遷移，目前仍不清楚。本研究熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，miR-320a mimics-WT-Pirh2組細胞熒光素酶活性明顯低于miR-320a mimics-MUT-Pirh2組，且miR-320a過表達降低NSCLC細胞中Pirh2的表達，提示miR-320a直接靶向Pirh2的3′UTR。本研究采用siRNA沉默NSCLC細胞中Pirh2表達，導致細胞增殖、遷移及侵襲能力顯著降低，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Pirh2細胞中Pirh2表達的提高則促進細胞增殖、遷移及侵襲。

綜上所述，miR-320a調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展的機制十分復雜。本研究發(fā)現(xiàn)miR-320a在人NSCLC癌組織和細胞系中表達下調(diào)，在體外miR-320a通過下調(diào)Pirh2的表達而抑制NSCLC細胞的增殖和遷移，但其下游可能存在的信號通路仍需進一步研究。