馬 彭，章文毅，梅海軍，柯 靖

（南通大學附屬醫(yī)院普外科，江蘇 226001）

胃癌作為全球第四高發(fā)腫瘤，其死亡率高居第二位[1]。胃癌在中國的發(fā)生率位居腫瘤第二位，僅次于肺癌[2]。多數(shù)胃癌患者在診斷時已晚期，預后較差[3-5]。胃癌發(fā)生發(fā)展進程復雜，涉及致癌基因和抑癌基因間的相互作用以及多條信號通路的交叉作用，因此尋找與胃癌診斷及發(fā)展進程相關(guān)的分子，明確其參與胃癌增殖的分子機制，對胃癌的早期診斷和治療具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類小分子非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)方式影響靶基因的表達[6]。miRNA可調(diào)控多個細胞生物學過程，包括增殖、凋亡、運動和分化[7]。研究表明，miRNA在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，許多miRNA可作為胃癌潛在的標記物和治療靶標[8-10]。miR-320成員包括miR-320a，miR-320b，miR-320c，miR-320d和miR-320e，其中miR-320d和miR-320e僅存在于靈長類和人類[11]。miR-320在多種腫瘤中低表達，包括乳腺癌[12]，肝管細胞性肝癌[13]，肝細胞癌[14]，肺癌[15]和結(jié)直腸癌[16]等。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和結(jié)直腸癌中miR-320b的異常與腫瘤細胞增殖及侵襲力有關(guān)[17-18]。

信號通路的激活或抑制在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮非常重要的作用[19]，其中PI3K-AKT信號通路的激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20-21]，可促進腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，抑制凋亡，促血管生成及誘導化療和放療抗性[22]。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路，如miR-145通過抑制PI3K-AKT的活化而抑制喉鱗狀細胞癌的增殖[16]，miR-944結(jié)合IGF-1R后抑制PI3K-AKT信號通路活化，從而抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展[23]，miR-567-PI3KAKT-c-Myc細胞環(huán)路參與調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展及耐藥過程[24]。本研究旨在研究miR-320b在胃癌組織中的表達，探究其是否通過PI3K-AKT信號通路而調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞株 DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（Gibco公司），Trizol提取試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000TM（Invitrogen公司），miR-320b mimics、miR-320b inhibitor及陰性對照miRNC（廣州銳博生物科技有限公司），CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（Biosharp公司），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（BD Bioscience），5’-溴-2’-脫氧尿嘧啶（BrdU）標記物（Sigma公司），小鼠抗人BrdU抗體（貨號:ab8152,Abcam公司），驢抗小鼠熒光二抗（Jackson Immuno公司）。兔抗PI3K（phospho Y607）（貨號:ab235266,Abcam公司），兔抗AKT（phospho T308）（貨號:ab38449,Abcam公司），小鼠抗β-actin（貨號:ab8227，Abcam公司）。人胃癌細胞系MGC-803，MKN45和正常胃上皮細胞GES-1細胞株（上海中科院細胞庫）。

1.2 組織標本來源 收集2019年1月—2020年12月南通大學附屬醫(yī)院手術(shù)切除的66例胃癌及癌旁組織標本，均經(jīng)組織病理學確診，其中男性38例，女性28例，年齡44～81歲，中位年齡58歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，患者均簽署知情同意書。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胃癌細胞MGC-803、MKN45和正常胃上皮細胞GES-1細胞株采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當MGC-803和MKN45細胞生長至對數(shù)生長期時，以0.25%胰酶消化后接種于6孔板。待細胞融合度達到50%～60%時，按照試劑說明書操作步驟進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:取5μL Lipofectamine 2000TM加入500μL DMEM基礎培養(yǎng)基中，分別吸取10μL mi R-320b mimics，miR-320b inhibitor或miR-NC對照儲存液加入500μL無血清DMEM高糖基礎培養(yǎng)基中。室溫孵育20 min，隨后將兩者混勻，室溫孵育30 min。將miR-320b mimics、miR-320b inhibitor、miR-NC和轉(zhuǎn)染試劑的混合液加入細胞，終濃度為80 nmol/L，miR-320b mimics和inhibitor終濃度為150 nmol/L。6 h后更換為新鮮含血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.4 熒光定量PCR反應 胃癌、癌旁組織及轉(zhuǎn)染前后細胞株，采用Trizol法提取RNA，分光光度計檢測RNA濃度及純度。參照cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA合成，以snU6為內(nèi)參，構(gòu)建20μL熒光定量PCR反應體系:逆轉(zhuǎn)錄cDNA 2μL，SYB R Green預混液10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，DEPC水6μL。反應條件:95℃5 min，95℃10 s和58℃20 s，40個循環(huán)。每份標本重復檢測3次，取平均值為CT值。利用2-ΔΔCt計算mi R-320b相對表達量。

1.5 CCK-8細胞增殖實驗 在96孔板中每孔接種約5 000個MGC-803或MKN45細胞，待細胞完全貼壁后，按照上文實驗步驟分別轉(zhuǎn)染mi R-320b mimics、mi R-320b inhibitor和mi R-NC。在轉(zhuǎn)染后0、1、2、3 d加入10μL CCK-8檢測試劑，反應4 h后吸取上清液，使用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度。每次檢測取3個復孔，使用GraphPad Prism軟件繪制細胞生長曲線。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的MGC-803和MKN45細胞，分別轉(zhuǎn)染mi R-320b mimics、mi R-320b inhibitor、miR-NC，48 h后收集細胞。以預冷的1×PBS緩沖液洗2遍，加入300μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，最后加入5μL PI染料和5μL Annexin V-FITC染料，充分混合均勻，室溫避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡，使用艾森流式分析軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 Western blot法測定p-PI3K和p-AKT蛋白表達 取轉(zhuǎn)染48 h后的MGC-803和MKN45細胞，采用RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)每孔蛋白上樣總量30μg計算蛋白上樣體積。配制12%SDS-PAGE凝膠，濃縮膠電泳條件為70 V電泳1 h，分離膠為100 V電泳2 h。電泳結(jié)束后取SDS-PAGE凝膠將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件設置為100 V，65 min。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，洗膜，加一抗，4℃孵育過夜。第二天用1×TBST洗膜3次，每次5 min，再加入二抗室溫孵育2 h。采用ECL化學發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以±s示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-320b在胃癌組織和細胞株中的表達 實時熒光定量PCR檢測顯示，胃癌組織中miR-320b表達顯著低于癌旁組織（P＜0.001），胃癌細胞株MGC-803和MKN45中miR-320b表達均顯著低于胃上皮細胞GES-1（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。見圖1A、1B。

圖1 miR-320b在胃癌組織及胃癌細胞株中表達

2.2 miR-320b表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 臨床分期T3、T4患者miR-320b表達低于T1、T2患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-320b表達低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），而miR-320b表達與患者性別、年齡及腫瘤細胞分化程度無關(guān)。見表1。

表1 miR-320b表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.3 mi R-320b抑制MGC-803和MKN45胃癌細胞增殖能力 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miRNC比較，轉(zhuǎn)染miR-320b inhibitor的MGC-803和MKN45細胞增殖明顯增加，轉(zhuǎn)染miR-320b mimics的MGC-803和MKN45細胞增殖明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示mi R-320b可以抑制胃癌細胞MGC-803和MKN45的增殖能力。見圖2。

圖2 CCK-8法檢測miR-320b抑制胃癌細胞株增殖

2.4 mi R-320b促進胃癌細胞MGC-803和MKN45細胞凋亡 與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-320b mimics的MGC-803和MKN45凋亡細胞比例增加，主要為Annexin V+/PI+細胞比例增加（右上象限），而轉(zhuǎn)染miR-320b inhibitor的MGC-803和MKN45凋亡細胞比例降低，提示miR-320b促進胃癌細胞MGC-803和MKN45凋亡。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測miR-320b促進胃癌細胞凋亡

2.5 miR-320b抑制PI3K/AKT信號通路的激活 為了進一步明確miR-320b參與胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，采用Western blot法檢測胃癌細胞轉(zhuǎn)染后pAKT，pPI3K和總AKT、PI3K表達。結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-320b mimics的MGC-803和MKN45細胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達均顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-320b inhibitor的MGC-803和MKN45細胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達均顯著增加，而總PI3K和AKT水平無明顯變化。見圖4。

圖4 Western blot檢測miR-320b抑制胃癌細胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達

3 討 論

越來越多的研究表明miRNA在人類多種疾病中異常表達，包括帕金森病[25]、糖尿病[26]、動脈粥樣硬化[27]、免疫疾病[28]，特別是惡性腫瘤[29-32]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA異常表達可影響胃癌細胞增殖、凋亡和侵襲[33-35]，如miR-140-5p結(jié)合THY1抑制Notch通路活化，從而抑制胃癌細胞增殖、侵襲、遷移等生物學進程[36]，miR-106a調(diào)節(jié)TFAP2E甲基化介導MGC-803細胞耐藥[37]。本研究結(jié)果顯示，與胃癌癌旁組織比較，胃癌組織中miR-320b表達量顯著降低，與結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤和鼻咽癌中的發(fā)現(xiàn)一致[1，38-39]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-320b可抑制膠質(zhì)瘤細胞[17]和結(jié)直腸癌細胞[38]增殖，促進細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染mi R-320 inhibitor可以特異性抑制MGC-803和MKN45細胞miR-320b表達，細胞增殖能力增加，凋亡率降低，提示miR-320b在胃癌細胞增殖過程中可能發(fā)揮抑制作用。

許多研究表明，在胃癌中PI3K/AKT信號通路發(fā)生改變，如常會出現(xiàn)PIK3CA（PI3K一個亞基）點突變[40-43]，在胃癌及其它腫瘤中PI3K/AKT信號通路通常被激活[44]。本研究結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-320b mimics的胃癌細胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達顯著下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-320b inhibitor的胃癌細胞p-PI3K和p-AKT蛋白表達顯著增加。miR-320b通過調(diào)節(jié)PI3K和AKT磷酸化水平影響腫瘤細胞的增殖、凋亡甚至化療和放療抗性[22]，從而在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，但miR-320b對PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)的具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，miR-320b在胃癌組織中表達下調(diào)，導致PI3K/AKT信號通路激活，提示miR-320b在胃癌中可能發(fā)揮重要的抑癌作用，顯著影響胃癌細胞的增殖和凋亡，這種作用可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路來實現(xiàn)的。