彭詩博，韓俊源，姚立，李穎，馬林*

1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心放射診斷科，北京 100853；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京 100850；4.中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所，北京 100190；*通信作者 馬林 cjr.malin@vip.163.com

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[1-2]，MRI在膠質(zhì)瘤診斷中發(fā)揮重要作用[3]，通過使用對(duì)比劑進(jìn)行T1WI增強(qiáng)掃描可以提高腫瘤診斷的特異性[4-5]。MR對(duì)比劑包括T1對(duì)比劑和T2對(duì)比劑[4,6]，既往研究中氧化鐵納米顆粒的粒徑較大，作為T2對(duì)比劑[7]用于肝臟疾病的增強(qiáng)掃描，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，調(diào)控氧化鐵納米顆粒的大小和表面結(jié)構(gòu)可以改變其弛豫性能[8-9]，當(dāng)粒徑較小時(shí)，可以作為T1對(duì)比劑使用[10-12]，在超高場(chǎng)強(qiáng)下具有優(yōu)于釓基對(duì)比劑的血管成像能力，并具有較大的表面積和良好的表面結(jié)構(gòu)，易于修飾或裝載靶向分子、熒光染料、放射性同位素和藥物，使納米顆粒具有早期診斷、多模態(tài)成像、靶向治療的應(yīng)用前景。目前國(guó)際上關(guān)于超小超順磁性氧化鐵（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）納米顆粒作為T1對(duì)比劑的研究尚局限在血管成像方向，或僅通過連接特異性探針后對(duì)單一腫瘤進(jìn)行成像使用。本實(shí)驗(yàn)使用的新型USPIO納米顆粒，在未連接探針的情況下即具備成為廣譜T1對(duì)比劑的潛力，該對(duì)比劑具有較好的血管成像能力。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠C6膠質(zhì)瘤模型，通過比較給藥后腫瘤組織強(qiáng)化率、正常組織與腫瘤組織的對(duì)比噪聲比（contrast noise ratio，CNR），探討其用于膠質(zhì)瘤T1WI增強(qiáng)掃描的可行性，并制訂合適的注射方案。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 雄性SD大鼠25只（斯貝福北京生物技術(shù)有限公司），體重250～300 g，SPF級(jí)。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司）培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，傳代、消化、離心后配制成濃度為1×105/μl的細(xì)胞懸液。大鼠麻醉后取俯臥位，用腦立體定位儀固定大鼠頭部，皮膚消毒后縱行切口，分離皮膚軟組織，充分暴露顱骨。將鉆孔靶點(diǎn)定位于冠狀縫后1 mm、矢狀縫右側(cè)3 mm處，用牙科鉆在顱骨的靶點(diǎn)處鉆孔。微量注射器吸取C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液10 μl，經(jīng)骨孔緩慢垂直進(jìn)針至硬膜下約6 mm，回退1 mm，注射速度為1 μl/min，注射完成后留針10 min，垂直緩慢退針，無菌骨蠟封閉骨孔，縫合傷口，單籠飼養(yǎng)。

1.2 試劑和配液 本研究使用的新型USPIO納米顆粒由蘇州大學(xué)研發(fā)，通過高溫?zé)岱纸夥椒ㄖ苽?，最終產(chǎn)品為棕色澄清水溶液，含鐵濃度為10 mg/ml，粒徑<5 nm，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)具有加速質(zhì)子的縱向弛豫能力。該試劑通過軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所的安全性測(cè)評(píng)。本實(shí)驗(yàn)采用5%葡萄糖溶液稀釋試劑，配制成濃度為1 mg/ml和5 mg/ml的USPIO納米顆粒溶液。

1.3 分組及實(shí)驗(yàn)方案 將25只大鼠C6膠質(zhì)瘤模型隨機(jī)分為5組，每組5只，每組經(jīng)大鼠尾靜脈注射不同濃度和體積的USPIO納米顆粒，依次為1組（5 mg/ml、5 ml/kg）、2組（10 mg/ml、0.5 ml/kg）、3組（10 mg/ml、5 ml/kg）、4組（10 mg/ml、10 ml/kg）、5組（1 mg/ml、5 ml/kg）。1組給藥后1、5、15、30、45、60 min進(jìn)行T1WI增強(qiáng)掃描，觀察不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤組織強(qiáng)化規(guī)律，確定最佳掃描時(shí)間，比較該掃描時(shí)間下不同體積組（2、3、4組）和不同濃度組（1、3、5組）的強(qiáng)化率和CNR。

1.4 MRI檢查 大鼠接種C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后第13天接受MRI檢查，采用GE Discovery MR750 3.0T MR掃描儀，選用八通道腕線圈，大鼠麻醉后俯臥固定，尾先進(jìn)。給藥前，采集大鼠顱腦軸位T2WI快速自旋回波序列：TR 3 060.0 ms，TE 109.8 ms，視野4 cm，矩陣224×192，層厚2 mm，層間距0.2 mm，激勵(lì)次數(shù)6；軸位T1WI：TR 727.0 ms，TE 12.1 ms，視野4 cm，矩陣224×192，層厚2 mm，層間距0.2 mm，激勵(lì)次數(shù)4。平掃結(jié)束后，經(jīng)鼠尾靜脈留置針快速推注相應(yīng)濃度和體積的USPIO納米顆粒，隨后在指定時(shí)間進(jìn)行T1WI增強(qiáng)掃描，掃描參數(shù)同前。

1.5 病理學(xué)檢查 大鼠結(jié)束MRI后，使用多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌流術(shù)，取出全腦放置于多聚甲醛溶液中固定。將標(biāo)本修塊、脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察成瘤情況。

1.6 圖像分析 由2名具有3年以上放射科工作經(jīng)驗(yàn)的副主任醫(yī)師采用盲法測(cè)量大鼠注射USPIO納米顆粒前后的T1圖像。感興趣區(qū)選定在同一層面腫瘤的實(shí)體部分（避開壞死、囊變、血管）、對(duì)側(cè)正常腦組織和背景噪聲處，面積設(shè)定為5 mm2，每個(gè)層面重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。計(jì)算強(qiáng)化率：強(qiáng)化率=（SI1－SI0）/SI0×100%，其中SI0、SI1分別為增強(qiáng)前后的腫瘤T1信號(hào)值。計(jì)算腫瘤組織和正常腦組織CNR：CNR=SNRa－SNRb=（SIa－SIb）/SD，其中SNRa、SNRb分別為腫瘤、正常腦組織的信噪比，SIa、SIb分別為同一層面腫瘤、正常腦組織的T1信號(hào)值，SD為背景噪聲的標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，1組不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤組織強(qiáng)化率和CNR比較采用重復(fù)測(cè)量資料方差分析，不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較采用SNK法。不同體積組（2、3、4組）、不同濃度組（1、3、5組）的強(qiáng)化率和CNR采用單向方差分析和多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較（SNK法），P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)中25只大鼠腦內(nèi)均有腫瘤生長(zhǎng)。HE染色后觀察可見腫瘤細(xì)胞密集，排列紊亂，生長(zhǎng)活躍，病理性核分裂象多見。新生毛細(xì)血管豐富，血管壁僅一層內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏平滑肌，基膜不連續(xù)。部分腫瘤組織中心可見壞死區(qū)。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤組織強(qiáng)化規(guī)律 平掃示大鼠腦膠質(zhì)瘤邊界不清晰，T1WI呈等或稍低信號(hào)。1組大鼠注射濃度為5 mg/ml、體積為5 ml/kg的USPIO納米顆粒后，分別在1、5、15、30、45、60 min行T1WI增強(qiáng)掃描，腫瘤組織在T1WI上信號(hào)逐漸升高，正常腦組織及壞死區(qū)信號(hào)未見明顯改變。腫瘤組織強(qiáng)化率從給藥后1 min開始升高，在45 min時(shí)達(dá)到峰值，經(jīng)檢驗(yàn)時(shí)間因素對(duì)強(qiáng)化率的變化有影響（F=19.33，P<0.05），同時(shí)30～60 min強(qiáng)化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。正常組織與腫瘤組織的CNR從給藥后1 min開始升高，在30 min時(shí)達(dá)到峰值，隨后開始降低，經(jīng)檢驗(yàn)時(shí)間因素對(duì)CNR的變化有影響（F=9.30，P<0.05），注射前與注射后的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)CNR差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1、2。

圖1 大鼠經(jīng)靜脈注射USPIO納米顆粒前后強(qiáng)化率（A）和CNR（B）隨時(shí)間的變化

圖2 大鼠靜脈注射USPIO納米顆粒前（A）及注射后1 min（B）、5 min（C）、15 min（D）、30 min（E）、45 min（F）、60 min（G）T1WI圖像。膠質(zhì)瘤組織HE染色鏡下表現(xiàn)（×400，H）

2.3 不同給藥體積的腫瘤組織MR強(qiáng)化特征 3組大鼠平掃后分別注射相同濃度（10 mg/ml）、不同體積（0.5、5、10 ml/kg）的USPIO納米顆粒，注射對(duì)比劑后30 min進(jìn)行T1WI增強(qiáng)掃描。0.5、5、10 ml/kg組的強(qiáng)化率分別為11.8%、26.9%、11.8%，3組間強(qiáng)化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.14，P<0.05），5 ml/kg組強(qiáng)化率顯著優(yōu)于0.5 ml/kg組和10 ml/kg組（P<0.05），0.5 ml/kg組和10 ml/kg組的強(qiáng)化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。0.5 ml/kg組、5 ml/kg組、10 ml/kg組的CNR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.96，P<0.05），5 ml/kg組的CNR優(yōu)于0.5 ml/kg組（P<0.05），5 ml/kg組和10 ml/kg組的CNR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖3、表1。

表1 不同體積USPIO納米顆粒增強(qiáng)后的強(qiáng)化率和CNR比較（±s）

表1 不同體積USPIO納米顆粒增強(qiáng)后的強(qiáng)化率和CNR比較（±s）

注：a與0.5 ml/kg組比較，P<0.05；b與5 ml/kg組比較，P<0.05

項(xiàng)目給藥體積0.5 ml/kg 5 ml/kg 10 ml/kg強(qiáng)化率（%） 11.8±3.7 26.9±6.0a 11.8±6.0b CNR 1.549±1.208 4.453±1.819a 2.752±0.780

圖3 大鼠靜脈注射不同體積USPIO納米顆粒前后T1WI圖像。A、B、C分別為D、E、F給藥前的平掃圖像，D～F分別為給藥體積0.5 ml/kg、5 ml/kg、10 ml/kg

2.4 不同給藥濃度的腫瘤組織MR強(qiáng)化特征 3組大鼠平掃后分別注射相同體積（5 ml/kg）、不同濃度（1、5、10 mg/ml）的USPIO納米顆粒，注射對(duì)比劑后30 min進(jìn)行T1WI增強(qiáng)掃描。1、5、10 mg/ml組的強(qiáng)化率分別為13.7%、26.4%、26.9%，3組間強(qiáng)化率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.77，P<0.05），5 mg/ml組和10 mg/ml組的強(qiáng)化率均優(yōu)于1 mg/ml組（P<0.05），5 mg/ml和10 mg/ml組的強(qiáng)化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。1、5、10 mg/ml組的CNR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.73，P<0.05），5 mg/ml和10 mg/ml組的CNR均優(yōu)于1 mg/ml組（P<0.05），5 mg/ml和10 mg/ml組的CNR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2、圖4。

圖4 大鼠靜脈注射不同濃度USPIO納米顆粒前后T1WI圖像。A、B、C分別為D、E、F給藥前的平掃圖像，D～F分別為給藥濃度1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml

表2 不同濃度USPIO納米顆粒增強(qiáng)后的強(qiáng)化率和CNR比較（±s）

表2 不同濃度USPIO納米顆粒增強(qiáng)后的強(qiáng)化率和CNR比較（±s）

注：a與1 mg/ml組比較，P<0.05

項(xiàng)目給藥濃度1 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml強(qiáng)化率（%） 13.7±2.8 26.4±5.8a 26.9±6.0 a CNR 1.833±1.052 6.185±2.506 a 4.453±1.819 a

3 討論

膠質(zhì)瘤發(fā)病率高、治療復(fù)雜、預(yù)后較差，對(duì)人類健康構(gòu)成極大威脅[2]。在MR掃描中通過使用對(duì)比劑，可以增加腫瘤組織信號(hào)，使之與正常組織形成對(duì)比，有利于診斷膠質(zhì)瘤。本研究中大鼠C6膠質(zhì)瘤模型注射USPIO納米顆粒前后行MR掃描，通過觀察圖像，并計(jì)算腫瘤組織T1強(qiáng)化率、正常組織與腫瘤組織的CNR，量化該對(duì)比劑對(duì)膠質(zhì)瘤的強(qiáng)化效果。

正常腦組織在血-腦屏障的作用下不產(chǎn)生強(qiáng)化效果，但腫瘤組織強(qiáng)化明顯。有研究指出腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與血管生成互相促進(jìn)，腫瘤組織通過釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[13]，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞上囊泡狀細(xì)胞器的數(shù)量[14]，影響血管的通透性，進(jìn)而破壞局部血-腦屏障[15]。新型USPIO納米顆粒通過血液循環(huán)至顱內(nèi)血管，本研究中病理學(xué)結(jié)果可見腫瘤中新生血管的管壁較薄，基膜不連續(xù)，USPIO納米顆粒的粒徑較小，可由此處滲出，積聚在細(xì)胞外間隙，與既往研究結(jié)果一致，這種由腫瘤血管滲漏介導(dǎo)的高通透性和滯留性效應(yīng)[16]是MR對(duì)比劑在腫瘤部位成像的主要原理。在高通透性和滯留性效應(yīng)的影響下，USPIO納米顆粒被動(dòng)靶向腫瘤組織，在作為對(duì)比劑成像的同時(shí)，還為搭載納米藥物被動(dòng)靶向輸送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤組織提供了可能。

本研究采集給藥后1、5、15、30、45、60 min T1WI增強(qiáng)掃描圖像，強(qiáng)化率和CNR從給藥后1 min開始快速升高，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示給藥后30～60 min內(nèi)進(jìn)行增強(qiáng)掃描可以使腫瘤與正常組織之間產(chǎn)生較好的對(duì)比。不同體積組結(jié)果顯示，5 ml/kg組的腫瘤強(qiáng)化效果優(yōu)于0.5 ml/kg組，但增加給藥體積到10 ml/kg時(shí)，圖像出現(xiàn)較重偽影，解剖結(jié)構(gòu)顯示不清，強(qiáng)化率明顯降低。不同濃度組結(jié)果顯示，1 mg/ml組的腫瘤強(qiáng)化效果不明顯，當(dāng)給藥濃度升高至5 mg/ml和10 mg/ml時(shí)，腫瘤均出現(xiàn)明顯強(qiáng)化，但這兩組的強(qiáng)化率和CNR均值無明顯差異，表明腫瘤的強(qiáng)化效果并未隨著注射體積和濃度的增加而持續(xù)增加，推測(cè)是因?yàn)樽⑸錆舛冗^高時(shí)會(huì)出現(xiàn)磁敏感偽影，降低圖像質(zhì)量，反而不利于診斷。近年研究表明USPIO納米顆粒具有較好的血管成像能力[17]，在超高場(chǎng)強(qiáng)（≥7T）下能夠清晰地觀察到直徑為100 μm的血管[18]，但需要構(gòu)建探針才能夠用于腫瘤成像。本研究中新型USPIO納米顆粒能夠作為廣譜T1對(duì)比劑，兼?zhèn)淠[瘤成像能力和超高場(chǎng)強(qiáng)磁共振血管成像能力。此外，USPIO納米顆粒的良好表面結(jié)構(gòu)，使其具備構(gòu)建探針、搭載藥物等能力[19-21]，在腫瘤的早期診斷[22]和靶向治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景[23-26]。

本研究的局限性：首先，設(shè)置的給藥體積和濃度區(qū)間較大，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以設(shè)置更多分組，進(jìn)一步探究最佳注射方案；其次，個(gè)別組的強(qiáng)化率與CNR的變化趨勢(shì)不一致，可能由于每組大鼠膠質(zhì)瘤模型數(shù)量較少，個(gè)體差異所致，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究；最后，應(yīng)增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類，并逐步納入更多的疾病模型。

本研究中大鼠靜脈注射體積為5 ml/kg、濃度為5 mg/ml的新型USPIO納米顆粒后，在30～60 min進(jìn)行T1WI增強(qiáng)掃描，腫瘤組織信號(hào)明顯升高，與正常組織之間出現(xiàn)明顯信號(hào)差異，能夠達(dá)到滿意的強(qiáng)化效果。本研究中新型USPIO納米顆粒展示出作為廣譜T1對(duì)比劑的成像能力，有助于推進(jìn)腫瘤分子影像學(xué)的進(jìn)展，為后續(xù)研究超高場(chǎng)強(qiáng)MR對(duì)比劑奠定基礎(chǔ)。