申洪遠(yuǎn)，陶宏宇，張芙蓉，王晨雨，米成嶸

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院超聲科，寧夏 銀川 750004；*通信作者 米成嶸mcr69333@163.com

近年來(lái)，乳腺癌已居女性惡性腫瘤患病率的第一位[1-3]。手術(shù)、新輔助化療、內(nèi)分泌治療等在臨床上較為常見(jiàn)，但存在創(chuàng)傷面積大、易復(fù)發(fā)、全身副作用大、易耐藥等缺點(diǎn)，會(huì)降低患者的遠(yuǎn)期生存率，并加重患者的身心負(fù)擔(dān)。越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注腫瘤給藥方式的研究，納米粒（nanoparticles，NPs）作為載藥系統(tǒng)，在提高現(xiàn)有癌癥治療藥物的安全性和有效性方面具有巨大的潛力[4-5]，其具備的主動(dòng)靶向性為實(shí)現(xiàn)腫瘤區(qū)域的精準(zhǔn)給藥及提高治療效率打下了良好基礎(chǔ)。整合素αvβ3廣泛表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞表面及腫瘤新生血管表面（包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌和肺癌等），且極少表達(dá)于正常細(xì)胞表面[6]，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環(huán)肽（cRGD肽）能夠選擇性結(jié)合αvβ3，并可通過(guò)良好的細(xì)胞攝取能力有效靶向至腫瘤部位，在精準(zhǔn)納米載藥系統(tǒng)的靶向性方面發(fā)揮巨大作用[7]。近年來(lái)，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）作為親水組分引入到聚合物載體的研究較多，PEG主要通過(guò)嵌段或枝接，可有效改善藥物水溶性、增加藥物穩(wěn)定性和減輕免疫原性[8-13]。本研究將cRGD肽枝接于嵌段共聚物PEG-PLGA，構(gòu)建高分子復(fù)合納米造影劑cRGD-PEG-PLGA@PFP（cRGD-NPs），通過(guò)低強(qiáng)度聚焦超聲治療儀（LIFU），觀察其體內(nèi)外靶向性造影情況，探討cRGD-NPs作為靶向納米造影劑及載體精準(zhǔn)治療乳腺癌的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 cRGD-PEG-PLGA（MW∶14 579 D，cRGD∶578 D，PEG∶2 000 D，PLGA∶12 000 D，廣東碳水科技有限公司）、PEG-PLGA（MW∶14 000 D，PEG∶2 000 D，PLGA∶12 000 D，廣東碳水科技有限公司）、全氟戊烷（perfluoropentane，PFP）、二氯甲烷（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）、異丙醇（徐州天鴻化工有限公司）、聚乙烯醇（PVA，上海Aladdin），小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）細(xì)胞株（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），激光粒徑儀（Zetasizer Nano ZS-90，Malvern）、倒置光學(xué)顯微鏡（Olympus）、透射電鏡（Olympus）、激光共聚焦顯微鏡（Olympus）、LIFU（重慶海扶技術(shù)有限公司），BALB/c小鼠（4周，18～20 g，寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）分為靶向組及非靶向組，每組3只。

1.2 cRGD-NPs的制備 雙乳化法制得cRGD-NPs，用磁力攪拌器室溫?cái)嚢?～5 h使微球表面固化，盡量使二氯甲烷完全揮發(fā)，4℃離心3次（11 190 g，5 min），棄上清液，收集納米顆粒，于4℃冰箱保存。非靶向納米粒的制作：將無(wú)cRGD肽標(biāo)記的PEG-PLGA溶于有機(jī)溶劑二氯甲烷中，其余制作步驟與cRGD-NPs一致。

1.3 cRGD-NPs的基本特征檢測(cè) 核磁氫譜驗(yàn)證cRGD-PEG-PLGA連接情況，溶劑為DMSO；使用Malvern粒度儀、光學(xué)顯微鏡、透射電鏡觀察cRGD-NPs大小、電位特征及分布情況。

1.4 cRGD-NPs體外生物安全性 應(yīng)用CCK8溶液檢測(cè)不同時(shí)間、不同濃度（0、0.2、0.4、0.8 mg/ml）cRGD-NPs對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生的影響，將4T1細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約1×105個(gè)/ml，37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h，將不同濃度PBS稀釋的cRGD-NPs（0、0.2、0.4、0.8 mg/ml）加入不同復(fù)孔中，共同孵育24 h。于不同時(shí)間段（6、12、24 h）每孔加入100 μl配置好的CCK8溶液，1～4 h后，酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)下的吸光值，檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算方法：細(xì)胞存活率（%）=[（實(shí)驗(yàn)孔吸光度－空白孔吸光度）/（對(duì)照組吸光度－空白孔吸光度）]×100%。

1.5 cRGD-NPs體外靶向性的評(píng)估 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4T1細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml每孔接種于共聚焦培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h，分為cRGD-NPs組和非靶向納米粒組。DiL標(biāo)記cRGD-NPs制作方法：將DiL染料在超聲乳化前溶于二氯甲烷中，其余步驟同cRGD-NPs制作，每個(gè)培養(yǎng)皿加入1 ml DiL標(biāo)記的cRGD-NPs/非靶向納米粒。將兩組處理后，細(xì)胞正常培養(yǎng)條件下孵育4 h，4%多聚甲醛1 ml固定15 min，PBS沖洗3次，加入DAPI染色劑對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察每組與細(xì)胞的結(jié)合情況。

1.6 體內(nèi)尋靶實(shí)驗(yàn) 乳腺癌小鼠模型建立后（4T1細(xì)胞劑量：104～105/ml，0.2 ml/只），待腫瘤長(zhǎng)至100 mm3，應(yīng)用IVIS光譜成像系統(tǒng)，采用組織熒光成像技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中納米粒的分布和代謝情況。DiL標(biāo)記兩組納米粒，標(biāo)記方法同上；具體操作：裸鼠吸入麻醉后，分別經(jīng)尾靜脈注射相同劑量、相同濃度（100 μl，0.1 mg/ml）的cRGD-NPs/非靶向納米粒，觀察納米粒在體內(nèi)聚集情況，熒光觀察條件：激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)510 nm。

1.7 cRGD-NPs相變及體外顯影 制作瓊脂糖模型進(jìn)行體外成像，取16 g瓊脂糖粉末加入400 ml雙蒸水，加熱溶解，冷卻后置于4℃等待模型固化。取1 mg/ml cRGD-NPs，經(jīng)LIFU（4 W/cm2）輻照不同時(shí)間（輻照前、60 s、120 s、輻照后），光鏡下觀察聲致相變變化；另取部分樣品置于EP管中，觀察不同溫度條件下（室溫、40℃、45℃、50℃、55℃）cRGD-NPs的變化趨勢(shì)，從而探求cRGD-NPs穩(wěn)定性及熱致相變能力。使用Simons超聲診斷儀（探頭頻率4～10 MHz，MI：0.12）觀察cRGD-NPs常規(guī)超聲及超聲造影（CEUS）模式下不同顯影效果。

1.8 cRGD-NPs體內(nèi)顯影 待乳腺癌腫瘤體積長(zhǎng)至100 mm3左右時(shí)，每只小鼠經(jīng)鼠尾靜脈注入100 μl濃度為1 mg/ml的cRGD-NPs，經(jīng)LIFU（4 W/cm2，120 s）輻照后，使用邁瑞超聲診斷儀（探頭深度0.05 cm，探頭頻率4～12 MHz，MI：0.06）進(jìn)行二維超聲及CEUS評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 cRGD-NPs的基本表征 將制得的cRGDPEG-PLGA溶解于DMSO溶液，獲得核磁氫譜掃描分析結(jié)果（圖1），HNMR光譜法測(cè)定產(chǎn)物的組成和分子量。以DMSO為溶劑，觀察到cRGD（多個(gè)氫鍵峰）、PEG（3.580 ppm）和PLGA（1.464、4.906、5.205 ppm）的特征化學(xué)位移，顯示cRGD與PEG-PLGA，cRGD連接成功占比含量約4%。制得cRGD-NPs呈乳白色懸浮液；光學(xué)顯微鏡下形態(tài)規(guī)則、大小均一（圖2A）；透射電鏡下cRGD-NPs外觀呈球形，表面光滑（圖2B、C）；Malvin粒度儀測(cè)量其平均粒徑為（93.19±31.41）nm，多分散指數(shù)為0.11，Zeta電位為8.25 mV（圖2D、E）；載藥結(jié)果顯示，cRGD-NPs包載率可達(dá)（80.13±4.81）%。CCK8試驗(yàn)結(jié)果顯示將不同濃度（0、0.2、0.4、0.8 mg/ml）cRGD-NPs混懸液與細(xì)胞孵育不同時(shí)間段（6、12、24 h），細(xì)胞活力均高于85%（圖2F）。

圖1 cRGD與PEG-PLGA連接情況

圖2 cRGD-NPs的基本特征。A.光學(xué)顯微鏡下cRGD-NPs形態(tài)（×4）；B、C.透射電鏡下cRGD-NPs為大小均一、形態(tài)規(guī)則的球形結(jié)構(gòu)（×20）；D、E. Malvin粒度儀測(cè)量cRGD-NPs，Zeta電位呈負(fù)電，單一峰；F. CCK8溶液檢測(cè)cRGD-NPs安全性

2.2 體外靶向性評(píng)價(jià) 納米粒經(jīng)DiL染色后呈紅色，4T1細(xì)胞經(jīng)DAPI染色后顯示為藍(lán)色，熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡下觀察，cRGD-NPs組藍(lán)色染色區(qū)及周圍顯示大量紅色熒光（即被熒光染色后的小鼠乳腺癌細(xì)胞吞噬吸收納米粒于細(xì)胞核周圍），部分可穿透核膜（即少部分cRGD-NPs可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)）；非靶向納米粒組大部分熒光散在分布，并未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞核及周圍僅顯示少量紅色熒光，且熒光強(qiáng)度明顯少于cRGD-NPs組（圖3）。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取納米粒情況。DiL標(biāo)記的cRGD-NPs較多聚集于DAPI染色的細(xì)胞核周圍，紅色熒光與藍(lán)色熒光存在重疊，且熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于非靶向納米粒組，放大倍數(shù)為20倍；箭示紅色熒光代表的cRGD-NPs出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)

2.3 動(dòng)物體內(nèi)靶向性驗(yàn)證 裸鼠背部偏右側(cè)種瘤3 d后，即可觸及米粒大小瘤塊組織，1～2周左右腫瘤體積可長(zhǎng)至80～100 mm3大小。按照上述分組在注射DiL標(biāo)記cRGD-NPs/非靶向納米粒后1 h內(nèi)行小動(dòng)物活體成像。與健康小鼠成像圖像比較發(fā)現(xiàn)，cRGD-NPs組熒光強(qiáng)度大多出現(xiàn)在腫瘤及周圍區(qū)域，非靶向納米粒組熒光強(qiáng)度明顯低于cRGD-NPs組，且腫瘤部位熒光聚集程度較差（圖4）。

圖4 小動(dòng)物活體成像。A.非靶向納米粒組；B. cRGD-NPs組；紅圈區(qū)域?yàn)槟[瘤組織

2.4 cRGD-NPs相變能力及體外顯影 熱致相變顯示cRGD-NPs隨著溫度升高，粒徑不斷增大，不斷產(chǎn)生新的氣泡，cRGD-NPs可在50℃左右仍然保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，形狀呈規(guī)則球形，溫度達(dá)到55℃時(shí)cRGD-NPs開(kāi)始破裂，此外，45℃條件下持續(xù)加熱2 min，cRGD-NPs直徑未繼續(xù)變大但其規(guī)則球形外殼發(fā)生改變，趨于破裂狀態(tài)（圖5）。經(jīng)LIFU（4 W/cm2）輻照后，隨輻照時(shí)間增加，可觀察到cRGD-NPs直徑逐漸增大直至破裂（圖6），并且伴隨LIFU輻照，瓊脂糖模型中cRGD-NPs的二維及造影效果也隨之呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)變化（圖6D～G）。

圖5 光學(xué)顯微鏡觀察不同溫度下cRGD-NPs變化趨勢(shì)（×20）。A.室溫；B.加熱至40℃，直徑增大，開(kāi)始產(chǎn)生氣泡；C.加熱至45℃，直徑變大，并產(chǎn)生新的氣泡；D. 45℃持續(xù)加熱2 min后，增大的氣泡不再呈規(guī)整球形，接近破裂形態(tài)；E.加熱至50℃，大量cRGD-NPs直徑增大，之前增大的氣泡再次增大，增大的氣泡越來(lái)越多；F.繼續(xù)加熱至55℃，大量氣泡破裂，僅剩外殼

圖6 光學(xué)顯微鏡觀察cRGD-NPs相變及相應(yīng)體外成像效果（×20）。A～D為經(jīng)LIFU輻照前、輻照60 s、輻照120 s及輻照后光鏡下cRGD-NPs變化情況，E～H為其對(duì)應(yīng)造影效果；cRGD-NPs直徑伴隨LIFU輻射，粒徑逐漸增大，造影效果也逐漸增強(qiáng)，輻照120 s后可觀察到許多衍生小氣泡產(chǎn)生，增強(qiáng)效果達(dá)到最佳；輻照結(jié)束后cRGD-NPs破碎，且數(shù)量減少，超聲增強(qiáng)造影效果也隨之減弱

2.5 cRGD-NPs體內(nèi)顯影 對(duì)小鼠乳腺腫瘤進(jìn)行二維超聲及CEUS檢查，觀察到cRGD-NPs經(jīng)LIFU輻照后，腫瘤內(nèi)部呈不均勻增強(qiáng)效果（圖7）。

圖7 注射cRGD-NPs經(jīng)LIFU輻照后體內(nèi)顯影。A.二維超聲腫瘤成像；B.注射cRGD-NPs后CEUS模式成像

3 討論

超聲醫(yī)學(xué)及造影劑的革新推動(dòng)著其在診斷成像中的應(yīng)用。在材料合成、安全性能的推動(dòng)下，CEUS已經(jīng)從單純的超聲診斷應(yīng)用到臨床治療，為基于超聲的精準(zhǔn)治療應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)[11-13]。近年來(lái)，納米級(jí)造影劑因其精細(xì)的大小和較長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，已經(jīng)成為造影劑研究的重點(diǎn)，特別是針對(duì)腫瘤區(qū)域的成像及癌癥治療獲得國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本研究制得的cRGD-NPs呈大小均一、具有良好殼核結(jié)構(gòu)的球形結(jié)構(gòu)，細(xì)胞毒性較小，可作為優(yōu)質(zhì)外殼為后續(xù)載藥、載基因等研究提供基礎(chǔ)，是一種可以在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)、免疫原性低的載藥載基因載體。

3.1 cRGD-NPs實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向乳腺癌腫瘤細(xì)胞 高通透性和滯留效應(yīng)可以使納米?；蛭⑴菰隗w內(nèi)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向效應(yīng)，但其靶向性效率低限制了其后續(xù)發(fā)展。以細(xì)胞表面受體為目標(biāo)的主動(dòng)靶向遞送大大改善了這一不足，受到廣泛關(guān)注[7,14-17]。cRGD可與整合素競(jìng)爭(zhēng)性抑制結(jié)合腫瘤細(xì)胞及新生血管表面受體，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)利用cRGD與腫瘤表面特異標(biāo)志物整合素αvβ3實(shí)現(xiàn)納米粒主動(dòng)靶向乳腺癌細(xì)胞，納米粒體外攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)cRGD-NPs較多聚集于細(xì)胞核周圍，提示cRGD顯著提高了體外納米粒靶向效率；小動(dòng)物活體成像結(jié)果證實(shí)cRGD-NPs在體內(nèi)亦具有對(duì)乳腺癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向性。

3.2 cRGD-NPs相變能力具有實(shí)現(xiàn)超聲顯影及定點(diǎn)釋藥的潛能 PFP是一種壓力與溫度敏感的相變材料，沸點(diǎn)為29℃，當(dāng)?shù)竭_(dá)沸點(diǎn)時(shí)極易發(fā)生液-氣相變，極易從液態(tài)變?yōu)闅怏w，但在不同材料包括脂質(zhì)及其他高分子聚合物的納米載體中，氣化閾值會(huì)升高，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定相變[18-19]。本課題組前期研究[20-21]發(fā)現(xiàn)在4 W/cm2、120 s條件下，LIFU輻照成像效果最佳；由于LIFU本身能量可產(chǎn)生熱效應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)同樣型號(hào)的LIFU儀器產(chǎn)生熱量最高可達(dá)43℃，其分別觀察了LIFU聲致相變與熱致相變變化趨勢(shì)，熱致相變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)納米粒包裹后，PFP閾值明顯升高，40℃時(shí)開(kāi)始發(fā)生液氣相變，此過(guò)程可持續(xù)至55℃，并且在此過(guò)程中發(fā)現(xiàn)慣性空化效應(yīng)，即增大氣泡會(huì)衍生出更小的氣泡的現(xiàn)象。本研究進(jìn)行聲致相變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種相變模式具有相似的變化趨勢(shì)，即在經(jīng)過(guò)功率4 W/cm2的LIFU輻照后，cRGD-NPs剛開(kāi)始不斷產(chǎn)生逐漸增大的氣泡，并且120 s后，慣性空化效應(yīng)使小氣泡產(chǎn)生。此外，本研究選擇在LIFU產(chǎn)生熱量最高溫度（43℃左右）對(duì)cRGD-NPs進(jìn)行2 min（聲致相變及造影最佳條件）熱致相變觀察，觀察到接近爆破的塌陷納米粒，選取相同濃度cRGD-NPs進(jìn)行體外造影，顯示在不同輻照時(shí)間后，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，造影能力不斷增強(qiáng)；選取體外實(shí)驗(yàn)成像最佳條件下進(jìn)行體內(nèi)成像，發(fā)現(xiàn)腫瘤呈不均勻增強(qiáng)模式，以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)了納米粒成功包裹相變材料PFP，具有良好的熱致相變及聲致相變能力，并可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)超聲顯影，而且成功包裹PFP并實(shí)現(xiàn)不同輻照時(shí)間下造影，也反映該納米粒遞送藥物系統(tǒng)定點(diǎn)釋藥的潛能，為通過(guò)控制相變條件控制納米粒相變、納米粒的慣性空化效應(yīng)及藥物緩釋提供了可能。

3.3 不足與展望 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多種方法證實(shí)cRGD-NPs是一種具有主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞，并具有實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)釋藥以及藥物緩釋潛能，同時(shí)獲得CEUS的診療一體化的載藥系統(tǒng)。然而，本研究并未對(duì)cRGD-NPs靶向于腫瘤細(xì)胞的能力進(jìn)行定量分析，且并未對(duì)載藥后cRGD-NPs的抗腫瘤療效進(jìn)行研究，課題組將在后續(xù)研究中對(duì)cRGD-NPs的安全性、多模態(tài)成像及診療效果進(jìn)行深入探討。