張漫莉，王 強(qiáng)，劉 麗，劉紅芝

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193）

酵母β-葡聚糖是酵母細(xì)胞壁的重要組成之一，由β-1，3-糖苷鍵為主鏈，β-1，6-糖苷鍵為支鏈連接而成[1]，具有抗腫瘤[2-6]、抗氧化[7-8]、降血糖[9]、調(diào)節(jié)免疫力[10-12]、抗菌消炎[13]等多種生物活性。然而，其獨(dú)特的三股螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致溶解性極低，在食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用受限。為改善酵母β-葡聚糖的溶解性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)酵母β-葡聚糖進(jìn)行修飾改性，包括輻照[14]、熱降解[15]、離子液體-高壓微射流[16]等物理改性方法，磷酸酯化[17]、硫酸酯化[18]、酸解與堿解結(jié)合[19]等化學(xué)改性方法，以及酶解[20]等生物改性方法。生物改性方法主要通過(guò)酶切斷多糖內(nèi)部的鍵，使其分子質(zhì)量降低，以提高其溶解性。與物理、化學(xué)改性方法相比，生物改性法具有對(duì)環(huán)境友好、作用條件溫和、高效專一等優(yōu)點(diǎn)。

蝸牛酶是由纖維素酶、半纖維酶、果膠酶等40 多種酶組成的混合酶[21]，在食品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。李悅等[22]使用蝸牛酶降解茯苓多糖，以提高其水溶性，降解率達(dá)40.20%；張濤等[23]采用蝸牛酶降解殼聚糖，寡糖得率可達(dá)64.74%。可見(jiàn)，蝸牛酶降解多糖是一種提高多糖溶解性較為理想的方法，而蝸牛酶降解酵母β-葡聚糖的研究尚未報(bào)道。本文使用蝸牛酶水解酵母β-葡聚糖，為水溶性酵母β-葡聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)，以及擴(kuò)大酵母β-葡聚糖的應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

酵母β-葡聚糖，安琪酵母有限公司；蝸牛酶，北京索萊寶有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（分析純級(jí)）。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S4 恒溫震蕩水浴鍋，余姚市金表儀器有限公司；Freezee zone 6 真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；YP5001 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDO-9246A 烘箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；Seven Compact pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HELEOS-Ⅱ十八角度激光光散射，美國(guó)Wyatt 公司；Mastersizer 3000 激光粒度分析儀，馬爾文儀器有限公司；J-1500 圓二色譜儀，日本分光株式會(huì)社；Q50 熱重分析儀，美國(guó)TA 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 β-葡聚糖的酶解工藝 稱取一定量的β-葡聚糖溶于水中，震蕩水浴鍋中預(yù)熱5 min 后加入蝸牛酶，反應(yīng)一段時(shí)間后沸水浴5 min 將酶滅活。試驗(yàn)初始條件為底物質(zhì)量濃度10 mg/mL，酶添加量2%，溫度37 ℃，反應(yīng)時(shí)間60 min。在離心機(jī)中以4 800 r/min 轉(zhuǎn)速離心15 min，取10 mL 上清液烘箱恒重法測(cè)總得率，剩余樣品凍干備用。

保持其它條件不變，考察底物質(zhì)量濃度（10，15，20，25，30 mg/mL）、溫度（30，35，40，45，50 ℃）、時(shí)間（50，60，70，80，90 min）；酶添加量（1%，2%，3%，4%，5%）對(duì)水溶性β-葡聚糖得率的影響。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.3 水溶性β-葡聚糖得率的測(cè)定 將凍干樣品配制成適當(dāng)濃度溶液測(cè)總糖和還原糖含量，計(jì)算水溶性β-葡聚糖得率，公式如下：

水溶性β-葡聚糖得率（%）=（m總-m還）/β-葡聚糖的質(zhì)量×100

1.3.4 總糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[24]。

1.3.5 還原糖含量測(cè)定 采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖含量[25]。

1.3.6 溶解度測(cè)定 參考白文強(qiáng)[26]的方法并略作修改。取適量酶解處理前、后的β-葡聚糖樣品溶于水，攪拌30 min 后，4 000 r/min 離心15 min，取上清液放于恒重的帶蓋鋁盒中，105 ℃烘至恒重。

溶解度（%）=上清液中物質(zhì)質(zhì)量/β-葡聚糖質(zhì)量×100

1.3.7 粒徑分布 分別將酶解前、后的β-葡聚糖配制成溶液，使用Matersizer-3000 測(cè)定酶解前、后β-葡聚糖的粒徑分布。

光學(xué)體表成像系統(tǒng)在獲取體表影像時(shí)易受物體體表顏色及形狀影響，體表形狀與體內(nèi)靶區(qū)結(jié)構(gòu)是相對(duì)固定的關(guān)系，下顎及顱底以下內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)間的位置會(huì)隨體位變化，體表位置也容易變化，面部皮膚雖與內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)間的位置相對(duì)固定，但容易受情緒變化和外力推拉而變形[17]。本研究在行體表光學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)時(shí)，有10次治療前CBCT驗(yàn)證正常，體表光學(xué)監(jiān)測(cè)誤差異常增大，查明原因?yàn)槊嬲謹(jǐn)D壓面部皮膚致皮膚形變，重新擺位調(diào)整面罩位置后正常。故在患者面部體表影像不受外部原因影響時(shí)，與內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的位置相對(duì)固定，此時(shí)做體表光學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)時(shí)，體表光學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)可靠、穩(wěn)定，Moser等[15]有類似報(bào)道。

1.3.8 分子質(zhì)量測(cè)定 酶解前、后β-葡聚糖的分子質(zhì)量測(cè)定所用的液相系統(tǒng)為Agilent 1260，色譜柱為PL-gel MIXED-C 5 μm，以0.1% NaCl 溶液為流動(dòng)相和溶劑，將β-葡聚糖配制成1 mg/mL 溶液，0.45 μm 微膜過(guò)濾后進(jìn)樣。

1.3.9 熱穩(wěn)定性測(cè)定 參考范紅梅[20]的方法并略作修改。采用熱重分析儀研究酶解前、后β-葡聚糖的熱穩(wěn)定性變化。稱取6 mg 左右的固體粉末置于微型坩堝中，N2為吹掃氣體。溫度由30 ℃上升至500 ℃，加熱速度為15 ℃/min，N2流速為50 mL/min。

1.3.10 FT-IR 分析 將β-葡聚糖粉末與溴化鉀混合、研磨并壓片，在400～4 000 cm-1范圍對(duì)樣品進(jìn)行紅外掃描，掃描次數(shù)為64 次。

1.3.11 圓二色譜 參考Forget 等[27]的方法并修改，將β-葡聚糖配制成1 mg/mL 溶液，在190～250 nm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，以100 nm/min 速度進(jìn)行掃描，比色皿的光程為1 mm，每個(gè)樣品連續(xù)掃描3 次。

1.3.12 掃描電鏡 取適量樣品，用導(dǎo)電膠分別將酶解前、后的β-葡聚糖固定到樣品臺(tái)上，在真空噴涂?jī)x中進(jìn)行噴金處理，在12.5 kV 電壓下使用掃描電鏡進(jìn)行掃描觀察，拍攝β-葡聚糖的形貌。

1.3.13 數(shù)據(jù)處理 每組試驗(yàn)做3 次平行，軟件SPSS 26 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，Design-expert 8.0.6 設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，Origin 2019 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察底物質(zhì)量濃度、時(shí)間、酶添加量和溫度對(duì)水溶性β-葡聚糖得率的影響，如圖1a所示，隨底物質(zhì)量濃度的增加，水溶性β-葡聚糖的得率先增加后降低，在底物質(zhì)量濃度為15 mg/mL 時(shí)得率最高。這可能是在底物質(zhì)量濃度較低時(shí)，酶在溶液中自由活動(dòng)，與底物接觸較容易，有利于水解反應(yīng)的進(jìn)行；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度繼續(xù)增加，由于β-葡聚糖的吸水性，體系黏度增加，酶在體系中運(yùn)動(dòng)困難，與底物的接觸受到阻礙[20]，反應(yīng)很難進(jìn)行。

如圖1b所示，隨時(shí)間的增加，水溶性β-葡聚糖的得率先緩慢升高后略有下降，在水解時(shí)間為80 min 時(shí)最高。這可能是由于水解時(shí)間較短時(shí)，蝸牛酶將β-葡聚糖的糖苷鍵斷裂，使其水溶性增加；當(dāng)水解時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，蝸牛酶會(huì)進(jìn)一步水解水溶性β-葡聚糖使其成為分子質(zhì)量更小的糖[28]，水溶性β-葡聚糖的得率略有下降。

如圖1c所示，隨酶添加量的增加，水溶性β-葡聚糖的得率先增加后有所降低，在酶添加量為4%時(shí)得率最高。在酶添加量較低時(shí)，酶作用于酵母β-葡聚糖，水溶性β-葡聚糖的得率升高[29]；當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，由于酶與底物達(dá)到飽和，多余的酶作用于水溶性β-葡聚糖使其分解成二糖或單糖。

如圖1d所示，隨溫度的增加，水溶性β-葡聚糖的得率先增加后緩慢降低，在溫度為45 ℃時(shí)得率最高。在溫度低于45 ℃時(shí)，隨溫度增加，分子熱運(yùn)動(dòng)增加，有利于底物與酶之間接觸，水溶性β-葡聚糖的得率增加[8]；當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，酶的活性受到影響，因此水溶性β-葡聚糖的得率降低。

圖1 不同因素對(duì)水溶性β-葡聚糖得率的影響Fig.1 Effects of different factors on water-soluble β-glucan yield

2.2 工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 為確定水溶性β-葡聚糖的最優(yōu)工藝，以水溶性β-葡聚糖的得率為響應(yīng)值，時(shí)間、溫度和酶添加量作為自變量進(jìn)行Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行多元回歸擬合，所得二次多項(xiàng)回歸模型方程為：Y=56.63-0.92A+2.92B+4.09C+1.05AB+1.91AC-0.24BC-21.59A2-12.45B2-13.59C2。

由表3方差分析可知，該回歸模型P＜0.0001，回歸效果極顯著；失擬項(xiàng)P=0.3911，差異不顯著，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9955，調(diào)整后R2=0.9828，表明模型擬合度較好，在誤差允許的范圍內(nèi)，可以用該模型預(yù)測(cè)水溶性β-葡聚糖的得率。此外，各項(xiàng)式中B、C、A2、B2、C2、AC 對(duì)水溶性β-葡聚糖的得率影響極顯著，A 對(duì)水溶性β-葡聚糖的得率影響顯著；各因素對(duì)水溶性β-葡聚糖得率影響的順序是：酶添加量＞時(shí)間＞溫度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.3 交互作用分析 各因素的交互作用如圖2所示。圖2a 中，水溶性β-葡聚糖的得率隨酶添加量和時(shí)間的增加先增加后降低，且等高線圖呈偏圓形，表明兩因素的交互作用不顯著；圖2b 中，水溶性β-葡聚糖的得率隨酶添加量與溫度的增加先增加后降低，等高線圖呈橢圓形，表明兩因素間存在一定的相互作用；圖2c 中，水溶性β-葡聚糖的得率隨時(shí)間和溫度的增加先增加后下降，等高圖呈偏橢圓形但兩條線之間間隔較大，表明交互作用影響較弱。2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 響應(yīng)面預(yù)測(cè)最佳條件：溫度44.88 ℃，時(shí)間82.29 min，酶添加量4.30%。結(jié)合試驗(yàn)條件，將優(yōu)化條件修正為溫度45 ℃，時(shí)間83 min，酶添加量為4.30%。該條件下得到的水溶性β-葡聚糖得率的平均值為56.12%，和預(yù)測(cè)值無(wú)顯著性差異，這表明優(yōu)化后的最佳條件是可靠的，可將該回歸方程應(yīng)用到實(shí)際。

圖2 酶添加量、時(shí)間和溫度交互作用對(duì)水溶性β-葡聚糖得率的影響Fig.2 Interactive effects of enzyme addition amount，time and temperature on the yield of water-soluble β-glucan

2.3 溶解度

β-葡聚糖酶解前、后溶解性變化如圖3所示，β-葡聚糖幾乎不溶于水中，經(jīng)過(guò)酶解處理，水溶性β-葡聚糖的溶解性可達(dá)（89.74±0.62）%，顯著高于β-葡聚糖的溶解性；白文強(qiáng)[26]通過(guò)離子液體與微射流協(xié)同作用酵母β-葡聚糖使其溶解性提高到至（85.01±0.45）%，石繼奎等[30]通過(guò)機(jī)械活化使酵母β-葡聚糖的溶解性提高到37%。

圖3 酶解前、后β-葡聚糖的溶解度Fig.3 The solubility of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis

2.4 分子質(zhì)量分布

基于本課題組前期研究，β-葡聚糖的分子質(zhì)量為6.09×106u，Mw/Mn為1.38[31]。經(jīng)過(guò)酶解后，β-葡聚糖分解成不同片段，其分子質(zhì)量分別為2.99×106，6.68×104u 和1.40×104u，Mw/Mn分別為2.71，1.31 和1.54，這表明酶作用于β-1，3-糖苷鍵降低β-葡聚糖的分子質(zhì)量。與本文提高溶解性方式相同，段會(huì)軻[32]使用β-1，3-葡聚糖酶水解酵母β-葡聚糖，所得到的酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量降至6.38×105u和4.78×104u 且大分子產(chǎn)物具有抗癌作用；也有輻照處理提高溶解性的研究，輻照處理后酵母β-葡聚糖的分子質(zhì)量由175 ku 降至27.9 ku，且產(chǎn)物具有更好的抗氧化性和抗菌活性[33]。

2.5 粒徑

β-葡聚糖的粒徑變化如圖5所示，與β-葡聚糖的粒徑相比，水溶性β-葡聚糖的粒徑向左移動(dòng)，D[4，3]由67.49 μm 降低至38.25 μm，表明酶解可以減少顆粒尺寸。與Liu 等[34]研究的酶修飾猴頭菇多糖結(jié)果相似，猴頭菇多糖經(jīng)過(guò)酶解處理粒徑由396 nm 降低至122 nm。多糖的粒徑與分子質(zhì)量、內(nèi)在黏度和物理穩(wěn)定性有關(guān)，粒徑降低，分子質(zhì)量和黏度也會(huì)降低[35]，物理穩(wěn)定性提高[36]。

圖5 酶解前、后β-葡聚糖的粒徑Fig.5 Partical size of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis

2.6 熱穩(wěn)定性

使用熱重分析儀比較酶解前、后β-葡聚糖的熱穩(wěn)定性變化。由圖6可知，熱損失分為2 個(gè)階段：第1 階段為200 ℃以下，葡聚糖發(fā)生9.82%的質(zhì)量損失和水溶性β-葡聚糖發(fā)生6.54%的質(zhì)量損失，這是由于水分的蒸發(fā)或者水分中氫鍵的解析；第2 階段為200～500 ℃，該階段質(zhì)量損失較大，β-葡聚糖和水溶性β-葡聚糖的熱分解溫度分別開(kāi)始于249.8 ℃和241.0 ℃，而當(dāng)溫度達(dá)到500 ℃時(shí)，β-葡聚糖和水溶性β-葡聚糖的質(zhì)量損失分別達(dá)到88.98%和69.50%。與范紅梅[20]和Xu 等[37]的研究結(jié)果相似，這部分的質(zhì)量損失源自β-葡聚糖和水溶性β-葡聚糖的降解。

圖6 酶解前、后β-葡聚糖的熱重分析Fig.6 Thermogravimetric analysis of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis

2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

酶解前、后的酵母β-葡聚糖紅外光譜圖如圖7所示。樣品在1 030，1 369，1 651，2 924，3 423 cm-1處的吸收峰均為多糖特征吸收峰[38]，1 030 cm-1處吸收峰是-COO 的C=O 的伸縮振動(dòng)[39]；1 369 cm-1和2 924 cm-1分別屬于C-H 的變角振動(dòng)[39]、伸縮振動(dòng)[40]；3 423 cm-1處的寬峰是O-H 的伸縮振動(dòng)[28]。2 924 cm-1和1 369 cm-1處的吸收峰可表明酶解后β-葡聚糖仍以β-（1，3）-糖苷鍵連接[26，41]。

圖4 水溶性β-葡聚糖分子質(zhì)量圖譜Fig.4 The molecular weight of water-soluble β-glucan

圖7 酶解前、后β-葡聚糖的紅外光譜圖Fig.7 FT-IR of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis

圓二色譜是研究生物大分子結(jié)構(gòu)改變的一種快速、靈敏的手段，與蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊等結(jié)構(gòu)有所不同，多糖多以無(wú)規(guī)卷曲等靈活的結(jié)構(gòu)存在。圖8顯示了酶解處理前、后β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)變化，水溶性β-葡聚糖較未處理的β-葡聚糖不對(duì)稱性增加，且存在正負(fù)科頓效應(yīng)，表明水溶性β-葡聚糖具有高度有序的結(jié)構(gòu)[42]。Forget 等[27]在比較瓊脂糖與羧甲基瓊脂糖時(shí)發(fā)現(xiàn)，羧甲基化后瓊脂糖在183 nm 處的正吸收峰移動(dòng)到在191 nm處，該吸收峰為α 螺旋結(jié)構(gòu)，在203 nm 處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，與蛋白質(zhì)在217 nm 處的β-折疊結(jié)構(gòu)相似。在水溶性β-葡聚糖中，可看到在190 nm 和210 nm 處分別存在正吸收峰和負(fù)吸收峰，這表明其存在α-螺旋結(jié)構(gòu)和類β-折疊結(jié)構(gòu)。

圖8 酶解前、后β-葡聚糖的圓二色譜圖Fig.8 Circular dichroism spectra of β-glucan before and after enzymatic hydrolysis

2.8 顯微結(jié)構(gòu)

酶解前、后β-葡聚糖得微觀形態(tài)如圖9所示。經(jīng)過(guò)酶解處理后，β-葡聚糖得微觀形態(tài)變化明顯，酶解前β-葡聚糖表面較光滑，呈球狀；酶解后β-葡聚糖顆粒變小，呈大小不均且雜亂無(wú)章的片狀結(jié)構(gòu)，這有利于其與水分子的接觸，改善溶解性。

3 結(jié)論

本文研究了蝸牛酶改善β-葡聚糖溶解性的工藝、產(chǎn)物溶解性、熱穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，得到水溶性β-葡聚糖的最佳工藝為：底物質(zhì)量濃度15 mg/mL，溫度45℃，時(shí)間83 min，酶添加量4.30%，該條件下水溶性β-葡聚糖的得率最高。水溶性β-葡聚糖較β-葡聚糖的溶解性顯著提高，分子質(zhì)量降低，熱穩(wěn)定性增加；紅外光譜分析表明，水溶性β-葡聚糖與β-葡聚糖圖譜相似，仍以β-1，3-糖苷鍵連接，圓二色譜表明，水溶性β-葡聚糖的不對(duì)稱性增加；SEM表明β-葡聚糖經(jīng)過(guò)酶解后表面遭到破壞，更利于與水分子的接觸。β-葡聚糖溶解性的改善為其在食品、藥品、化妝品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。