章佳玫，吳祖芳，翁佩芳

（寧波大學食品與藥學學院 浙江寧波 315800）

接骨木（Sambucus nigra L.）屬忍冬科植物，廣泛分布于歐洲、西亞、北非和美國，接骨木果含有豐富分營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、多酚類、黃酮類和花青素等，常用于膳食補充劑[1-2]。Denev 等[3]利用固相萃取法提取了多種漿果的花青素，試驗結(jié)果顯示接骨木果的花青素提取物具有較高的氧自由基吸收能力，可達到5 783 μmol Trolox/g。Goud 等[4]研究表明接骨木果甲醇提取物對DPPH 自由基的清除能力可達62.56%，對大腸桿菌和惡臭假單胞菌具有較強的抑制能力。接骨木果可以開發(fā)成多種產(chǎn)品，目前市場上有果汁、果醬、果酒、啤酒等商品。接骨木果汁因豐富的花色苷含量而作為良好的食品天然著色劑[5]。Cordeiro 等[6]用5 種不同醋作為木炭烤豬里脊的調(diào)味料，研究其對豬里脊烤制過程中多環(huán)芳烴（PAH）產(chǎn)生的抑制作用，發(fā)現(xiàn)接骨木果醋對PAH 的抑制率最高，達到了82%。

植物天然化合物通過乳酸菌代謝進行生物轉(zhuǎn)化，其性能會發(fā)生較大的改變[7]，鄭莎莎等[8]利用干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌發(fā)酵紅酸湯，改善了紅酸湯的風味品質(zhì)，并提高了營養(yǎng)價值。葉盼等[9]選取植物乳桿菌發(fā)酵蘋果汁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘋果汁發(fā)酵后其抗氧化能力得到提高，總酚含量有所增加，蘋果汁經(jīng)發(fā)酵后的總酚含量與DPPH 清除能力呈顯著正相關(guān)性。

目前國內(nèi)外利用乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁的研究報道較少。Ricci 等[10]研究了接骨木果汁多酚體外代謝，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在發(fā)酵接骨木果汁過程中消耗咖啡酸和原兒茶酸，同時產(chǎn)生二氫咖啡酸和兒茶酚，新生成的二氫咖啡酸比咖啡酸具更強的抗氧化能力[11]。Ricci 等[12]利用植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵接骨木果汁并測定其揮發(fā)性風味物質(zhì)，結(jié)果表明植物乳桿菌具有較強的產(chǎn)芳香物質(zhì)的能力。

本文選用前期篩選獲得的植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2 對接骨木果汁進行發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中的理化指標及揮發(fā)性風味物質(zhì)，以期為接骨木果乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物乳桿菌L1（Lactobacillus plantarum L1）、發(fā)酵乳桿菌L2 （Lactobacillus fermentum L2），由寧波大學食品生物技術(shù)實驗室保藏；接骨木果粉，由寧波市北侖玉健醫(yī)藥科技有限公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PHS－3C 型pH 計，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；TE214S 分析天平，成都浩馳儀器有限公司；LDZX－40B Ⅰ型立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ－2D 型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；XPX 智能生化培養(yǎng)箱，江南儀器廠；5804R 高速大容量冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；CR-400 色差儀，日本Konica Minolta 公司；7890B-7000C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；全自動固相微萃取進樣系統(tǒng)，德國Gerstel 公司；50·30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭，美國Supelco 公司；VOCOL 毛細管柱（60 m×0.32 mm×1.8 mm），德國CNW 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液制備 將植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2 分別從試管斜面接種至50 mL MRS 肉湯中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁的制備 在接骨木果粉中以料液比1∶50 加入蒸餾水，加入8 g/100 mL 的蔗糖，調(diào)節(jié)pH 值至5.5，經(jīng)巴氏殺菌后，得到發(fā)酵基質(zhì)，冷卻后接入植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2（1∶1，接種量3%），于37 ℃條件下發(fā)酵36 h。

1.3.3 理化指標測定 采用數(shù)字式pH 計測定樣品pH 值；采用pH 電位法（以乳酸計）測定總酸含量[13]；采用CR－400 色差儀測定樣品的色差值；采用pH 示差法測定樣品花色苷含量[14]；采用福林酚法測定樣品總酚含量[15]；采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定樣品總黃酮含量[16]；通過測定超氧陰離子清除率[17]、總還原力表征樣品抗氧化能力[18]。

1.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

1.4.1 GC-MS 分析-頂空進樣 固相微萃取條件：樣品在60 ℃下震蕩平衡15 min，再將預(yù)先老化20 min 的SPME 萃取頭深入到樣品頂空處吸附20 min，此過程中溫度仍為60 ℃并持續(xù)震蕩。吸附完成后，將萃取頭插入到GC 進樣口，在210 ℃溫度下解吸7 min。GC 色譜條件：進樣采用不分流模式，柱溫箱起始溫度35 ℃保持3 min，以3 ℃/min，升溫至40 ℃保持1 min，再以5 ℃/min 升溫至200℃保持12 min。載氣為高純氦氣，流速為1.6 mL/min；進樣口溫度210 ℃。MS 條件為EI 離子源；電子能量70 eV；燈絲發(fā)射電流為200 μA，離子源溫度為230 ℃；掃描質(zhì)量范圍50～500 m/z。

1.4.2 定量定性分析 化合物經(jīng)NIST 14 譜圖庫檢索，選擇相似度大于80%的結(jié)果與質(zhì)譜圖庫中的標準譜圖進行對照、復(fù)合，進行人工譜圖解析確認其中的揮發(fā)性成分，相對百分含量按峰面積歸一化法進行計算[19]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗平行數(shù)為3 次，取平均值。所有數(shù)據(jù)采用Origin 9.1 軟件作圖，用SPSS 25 軟件進行相關(guān)性分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接骨木果汁發(fā)酵過程中理化指標分析

2.1.1 發(fā)酵過程中pH 值和總酸含量變化 pH 值的變化可反映發(fā)酵是否正常進行，總酸含量是發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標。接骨木果汁發(fā)酵過程中pH 值和總酸含量變化如圖1所示。

由圖1可見，接骨木果汁發(fā)酵期間pH 值隨著發(fā)酵時間的增加而不斷減小，發(fā)酵前期下降迅速，之后趨于平穩(wěn)；總酸含量則不斷上升。在發(fā)酵前期（0～6 h），pH 值迅速降低至4.01，總酸由0.32 mg/mL 升至0.97 mg/mL，由此可以推斷，發(fā)酵前6 h 是乳酸菌的生長對數(shù)期，生長迅速，產(chǎn)酸能力強。發(fā)酵第7～36 小時，pH 值下降緩慢，總酸持續(xù)上升，此時乳酸菌正經(jīng)歷對數(shù)期到穩(wěn)定期再到衰亡期的過度，產(chǎn)酸速度趨于平穩(wěn)并開始下降。

2.1.2 發(fā)酵過程中色差值的變化 色值中，L*值表示樣品的亮度，a*值表示樣品的紅綠色，b*值反映樣品的黃藍度。由圖2可見，發(fā)酵0～12 h，樣品的L*值有所提高，之后呈下降趨勢，與a*值大致趨勢相同，這可能是因為花色苷在不同酸堿環(huán)境中會呈現(xiàn)不同的顏色，調(diào)節(jié)了初始pH 值后，果汁顏色偏深紫，后因為發(fā)酵期間乳酸菌產(chǎn)酸，果汁pH 值下降，開始呈現(xiàn)原來的顏色。發(fā)酵前期L*值和a*值的變化與花色苷含量之間呈負相關(guān)，這一結(jié)果與Kwaw 等[20]的研究結(jié)果類似。b*值較為穩(wěn)定，且數(shù)值保持在-0.3 附近，說明樣品偏藍。ΔE*值代表樣品的色差綜合偏差值，接骨木果汁發(fā)酵過程中ΔE*值變化不大，說明樣品色澤變化并不明顯。

圖2 發(fā)酵過程中色差值的變化Fig.2 Variation of chromatic aberration during fermentation

2.1.3 發(fā)酵過程中花色苷含量的變化 接骨木果汁發(fā)酵過程中花色苷含量的變化結(jié)果如圖3所示，發(fā)酵前6 h，花色苷含量迅速從153.41 mg/L 降至130.62 mg/mL，發(fā)酵前期花色苷含量下降迅速，這是因為花色苷分子被β-葡萄糖苷酶水解為糖基和花色素[21]。由于花色苷在酸性條件下較穩(wěn)定，隨著發(fā)酵后期pH 值降低，花色苷含量下降的速度也有所降低。

圖3 發(fā)酵過程中花色苷含量的變化Fig.3 Changes of anthocyanin content during fermentation

2.1.4 接骨木果汁發(fā)酵過程中總酚總黃酮含量變化 由圖4可見，總酚含量在發(fā)酵過程的前12 h迅速從4.93 mg/mL 升至7.52 mg/mL，之后緩慢上升，至24 h 開始下降，發(fā)酵結(jié)束時含量為7.82 mg/mL；總黃酮含量在發(fā)酵過程的前6 h，由0.46 mg/mL 升至0.74 mg/mL，隨后呈緩慢上升趨勢，發(fā)酵結(jié)束時最終含量為1.03 mg/mL。經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵，接骨木果汁的總酚和總黃酮含量較發(fā)酵前分別提高了58.62%和123.91%，這與張宏志等[22]的研究結(jié)果相似。

圖4 發(fā)酵過程中總酚和總黃酮含量的變化Fig.4 Changes of total phenols and flavonoids during fermentation

2.1.5 接骨木果汁發(fā)酵過程中抗氧化能力變化由圖5可見，發(fā)酵過程中，接骨木果汁的超氧陰離子清除率和總還原力都呈現(xiàn)上升趨勢。發(fā)酵結(jié)束后，超氧陰離子清除率達到47.74%，較發(fā)酵前提高了82.07%，總還原能力為0.9 mg VC/mL，較發(fā)酵前提高了55.17%，表明接骨木果汁經(jīng)過發(fā)酵，具有良好的抗氧化能力。賴婷等[23]將乳酸菌接種于桂圓肉中，發(fā)現(xiàn)游離態(tài)的酚類和黃酮類物質(zhì)含量增加，鐵離子還原能力和氧自由基吸收能力兩種抗氧化性能有所提高。

圖5 發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化Fig.5 Changes of antioxidant capacity during fermentation

2.1.6 發(fā)酵接骨木果汁中活性物質(zhì)抗氧化能力相關(guān)性分析 發(fā)酵接骨木果汁總酚、總黃酮與超氧陰離子清除率、總還原力的相關(guān)性分析見表1。

表1 發(fā)酵接骨木果汁中活性物質(zhì)與抗氧化能力的相關(guān)性Table 1 Correlation between active substances and antioxidant capacity of fermented elderberry juice

結(jié)果表明，總酚、總黃酮與超氧陰離子清除率、總還原力具有顯著相關(guān)性，這說明總酚、總黃酮均有助于接骨木果汁的抗氧化能力。

2.2 接骨木果汁揮發(fā)性風味物質(zhì)含量分析

不同的接骨木果汁樣品 （發(fā)酵0 h、發(fā)酵36 h、未接菌對照組）各揮發(fā)性風味物質(zhì)相對含量結(jié)果如圖6所示，3 種接骨木果汁樣品共鑒定出99種揮發(fā)性風味物質(zhì)，其中醛類14 種、烯烴類13種、醇類17 種、酮類10 種、烷烴類5 種、酯類16種、其它類24 種，揮發(fā)性風味物質(zhì)分別為47、39種和39 種。從不同樣品組之間的聚類分析結(jié)果可以看出，發(fā)酵前、后和未接菌對照組的接骨木果汁差異性較大，揮發(fā)性風味物質(zhì)相似性較低。如圖7所示，與發(fā)酵前相比，接骨木果汁經(jīng)乳酸菌接種發(fā)酵后，烯烴類、醇類、酮類、烷烴類、酯類物質(zhì)的相對含量增加，醇類、酮類、烷烴類風味物質(zhì)個數(shù)增加，且產(chǎn)生了很多新的物質(zhì)。

結(jié)合圖6和圖7，接骨木果實經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，相比較發(fā)酵前樣品，醛類物質(zhì)相對含量減少約87.37%，減少幅度較大；烯烴類物質(zhì)相對含量增加102.03%，新生成相對含量較高的為9.97%的環(huán)己基亞乙烯和6.78%的3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯；醇類物質(zhì)在相對含量和種類上都有所增加，新生成相對含量較高的為4.42%的3-trans-（1，1-二甲基乙基）-4-反式甲氧基環(huán)己醇、3.42%的1-（2-己烯基）環(huán)己醇和4.94%的丙基環(huán)己醇；酮類物質(zhì)相對含量增加49.22%，其中含量較高的為5.35%的大馬士酮；烷烴類物質(zhì)相對含量增加186.38%；酯類物質(zhì)相對含量增加36.12%，其中增加幅度較大的物質(zhì)為10.32%的3Z-安琪庚酯；其它類物質(zhì)雖在相對含量上無明顯差異，但在種類上區(qū)別較大。

圖6 接骨木果汁樣品揮發(fā)性風味成分的測定結(jié)果Fig.6 Identifification of the volatile flavor components of elderberry juice samples

圖7 乳酸菌發(fā)酵接骨木果汁揮發(fā)性風味物質(zhì)的相對含量和種類個數(shù)Fig.7 Relative content and number of species of volatile flavor compounds in elderberry juice fermented by lactic acid bacteria

未接菌對照組的樣品中，醛類物質(zhì)的相對含量和種類和發(fā)酵前組較為相似；烯烴類物質(zhì)相對含量降低了40.42%；醇類物質(zhì)相對含量增加了139.02%，其中含量較高的為7.33%的順-2-甲基環(huán)己醇和7.21%的2-亞甲基環(huán)庚烷醇；未接菌對照組的酯類相對含量較發(fā)酵前組的降低了11.21%；其它類物質(zhì)的相對含量約為發(fā)酵前和發(fā)酵后樣品的1/2。

2.3 接骨木果汁揮發(fā)性風味物質(zhì)主成分分析

利用SPSS 25 軟件對3 種接骨木果汁樣品中的99 種揮發(fā)性風味化合物進行主成分分析，所得的主成分的特征值和貢獻率如表2所示，所得的3 種接骨木果汁樣品的主成分散點圖和揮發(fā)性風味物質(zhì)主成分散點圖分別如圖8和圖9所示。

圖8 接骨木果汁樣品的PCA 分析圖Fig.8 PCA analysis chart of elderberry juice samples

圖9 99 種揮發(fā)性風味物質(zhì)PCA 分析圖Fig.9 PCA analysis chart of 99 kinds of flavor components

由表2可知，特征值大于1 的共2 個主成分，總方差100%的貢獻率來自于第1 主成分和2 主成分，其方差貢獻率分別為60.253%、39.747%，說明這2 個主成分幾乎反映了原始變量的所有信息。

表2 2 個主成分的特征值和貢獻率Table 2 Eigenvalues and contribution rate of 2 principal components

以3 種接骨木果汁的第1 主成分值為橫坐標、第2 主成分值為縱坐標作散點圖得圖8，3 種接骨木果汁中，發(fā)酵前組位于第2 象限，發(fā)酵后組位于第4 象限，未接菌對照組位于第3 象限。3 種樣品在象限區(qū)域內(nèi)分布區(qū)間差異顯著，表明樣品在風味物質(zhì)組成上差異較大。

以99 種風味物質(zhì)的第1 主成分載荷值為橫坐標，第2 主成分的載荷值為縱坐標，繪制主成分散點圖，由圖9可見，第1 主成分中正影響揮發(fā)性物質(zhì)載荷系數(shù)達到0.9 以上的有31 種，主要為烷烴類、烯烴類、醇類、酮類、酯類和其它類，這些成分與第1 主成分有高的相關(guān)性，第1 主成分中的主要代表有2-乙基-4，5-二甲基-1，2-氧雜戊烷（0.992）、螺[2.4]庚烷-4，6-二烯（0.967）、4，6-庚烷基-3-酮（0.967）、雙環(huán)[2.2.1]庚烷-7-醇（0.967）、3，5-二甲苯基N-甲基氨基甲酸酯（0.967）；負影響揮發(fā)物質(zhì)載荷系數(shù)達到0.9 以上有10 種，大多為醛類，主要代表有4，5，6，7-四氫-2-氨基-6-乙基苯并噻吩-3-羧酸乙酯（-1）、甲基庚烯酮（-0.997）、5-乙基環(huán)戊-1-烯醛（-0.997）。第2 主成分中載荷較高的正影響揮發(fā)性物質(zhì)主要為烯類和醛類，正影響揮發(fā)性物質(zhì)載荷系數(shù)達到0.9 以上有31 種，其代表成分為右旋萜二烯（0.973）、（E）-2-庚烯醛（0.965）、2-乙基己烯醛（0.965）；負影響揮發(fā)物質(zhì)載荷較高的主要為酯類和其它類，其中10-甲基-8-十四碳-1-醇乙酸酯（-0.935）較高。第1 主成分代表烷烴類、烯烴類、醇類和酯類，第2主成分代表烯類和醛類。

結(jié)合圖8和圖9，發(fā)酵初始的接骨木果汁主要揮發(fā)性物質(zhì)為醛類，發(fā)酵后的接骨木果汁主要揮發(fā)性風味物質(zhì)為烯烴類、烷烴類和酯類，未接菌對照組的接骨木果汁主要揮發(fā)性風味物質(zhì)為醇類和醛類，3 種樣品在風味物質(zhì)的組成上有顯著差異。

3 討論

利用前期試驗篩選得到的植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2 混合發(fā)酵接骨木果汁，發(fā)酵過程中的pH 值和總酸含量的變化規(guī)律都是呈現(xiàn)相反狀態(tài)，說明乳酸菌在該體系中正常生長并產(chǎn)酸。

花色苷是一種天然植物色素，也是一種生物活性物質(zhì)，但穩(wěn)定性不高，多種因素例如pH 值、光照、氧、酶、酚酸、金屬離子等可影響其穩(wěn)定性[24]。本研究中，發(fā)酵之前由于調(diào)節(jié)了pH 值，導致接骨木果汁的顏色由原先的亮紫色變?yōu)榘底仙?，夏其樂等[25]利用乳酸菌發(fā)酵楊梅汁，在調(diào)節(jié)pH 值過程中，楊梅汁顏色由紅色變?yōu)樽仙?，這是由于花色苷的結(jié)構(gòu)可隨pH 值的變化發(fā)生轉(zhuǎn)換，顯色發(fā)生差異。發(fā)酵過程中果汁中的花色苷含量在前期迅速下降，這可能與發(fā)酵體系中的氧氣含量和微生物代謝產(chǎn)生的糖苷酶有關(guān)。隨著發(fā)酵后期pH 值的下降，對維持花色苷的穩(wěn)定性有一定的保護作用，在較低的pH 值條件下，接骨木果汁恢復(fù)到原本的顏色。

總酚含量的提高可能是由乳酸菌在發(fā)酵過程中使接骨木果汁中糖基化酚類化合物去糖基化所致[20]。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶和酸促進了酚類和類黃酮從復(fù)雜大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)楹唵涡》肿有问絒26-27]。當體系中的酚類物質(zhì)達到一定濃度時便會產(chǎn)生抑菌作用，或發(fā)酵菌種通過對酚類物質(zhì)的降解來維持自身生長，導致總酚含量的降低[28]。

3 種接骨木果汁樣品都含有比較豐富的右旋萜二烯，這種物質(zhì)有似鮮花的清淡香氣，果汁經(jīng)過發(fā)酵新生成了大馬士酮，這種物質(zhì)含有花香、果香和紫丁香的香氣特征[29]。在Di 等[30]的研究中，發(fā)酵前番茄汁的醛類最豐富，這一點與本試驗測定結(jié)果一致，接骨木果汁經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后，醛類物質(zhì)大量減少，醛類物質(zhì)經(jīng)乳酸菌代謝后分解為醇或被氧化為酸，醇類物質(zhì)的增加進而會使相應(yīng)的酯類物質(zhì)增加[31]，乳酸菌在接骨木果汁中代謝后賦予了果汁更豐富且令人愉快的風味。

4 結(jié)論

對接骨木果汁發(fā)酵過程中的理化指標及揮發(fā)性風味物質(zhì)進行了測定及分析，結(jié)果表明植物乳桿菌L1 和發(fā)酵乳桿菌L2 可以在接骨木果汁中正常發(fā)酵生產(chǎn)，且部分活性物質(zhì)例如總酚總黃酮和抗氧化能力可以得到較好的提升，從而使接骨木乳酸菌發(fā)酵果汁具有較好的保健效果。通過對比分析接骨木果汁發(fā)酵前后風味可知，發(fā)酵后的果汁在風味物質(zhì)的組成和相對含量上發(fā)生了較大的變化，豐富且改善了原有的風味。