梁力平，趙巖，于鑫淼，宋麗軍*

（1.商丘市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，河南 商丘 476000；2.蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.） 是鼠李科（Rhamnaceae）植物棗樹的果實(shí)[1-3]。紅棗富含單糖、有機(jī)酸、氨基酸、多酚、黃酮、三萜烯酸等多種營養(yǎng)素，具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抗炎癥、免疫調(diào)節(jié)及胃腸道保護(hù)等生理功效[4-6]。

我國現(xiàn)有棗樹品種700多個(gè)，主要分布在新疆南部、河北、陜西、山東、河南、山西、甘肅等地[7-9]。新疆具有適宜紅棗生長的地理和自然條件，棗樹栽培歷史可追溯到2 000多年前。目前，新疆紅棗種植面積超過66.67萬公頃，占全國種植總面積的30%以上，產(chǎn)量超過400萬噸，占全國總產(chǎn)量的50%以上[9-10]。新疆紅棗主要分布在環(huán)塔里木盆地區(qū)域的巴州、喀什、阿克蘇、和田以及吐哈盆地等，主要栽培品種為灰棗、駿棗、哈密大棗、贊皇棗、壺瓶棗、梨棗和冬棗等[10-12]。研究表明，紅棗的品種、栽培地理環(huán)境、氣候、土壤、貯藏條件等多種因素均對紅棗品質(zhì)有影響，不同品種的紅棗具有不同的成分組成和功能性[13-15]。但由于不同品種紅棗的化學(xué)成分不同，在棗樹品種的選育、栽培以及紅棗相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量評價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)化等方面存在一定的困難。因此，在不存在產(chǎn)地、栽培管理和氣候條件等差異的條件下，研究不同紅棗品種的化學(xué)特性具有重要意義。

本研究從新疆阿拉爾塔里木大學(xué)種質(zhì)資源基地采集了99個(gè)紅棗栽培品種，對其有機(jī)酸的種類和含量進(jìn)行系統(tǒng)測定；進(jìn)一步采用相關(guān)性分析、層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）法對99個(gè)品種紅棗進(jìn)行了多變量統(tǒng)計(jì)分析。研究結(jié)果為在不存在區(qū)域差異的情況下，更好地了解不同棗樹品種的化學(xué)成分提供了依據(jù)，為棗樹品種的選育、栽培以及紅棗相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量評價(jià)和標(biāo)準(zhǔn)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

紅棗：采集于新疆阿拉爾市塔里木大學(xué)種質(zhì)資源基地，采樣時(shí)間為2018年10月20日—11月20日，各個(gè)品種樣品均處于紅熟期。從樹的四周隨機(jī)采集無病害、無機(jī)械傷的紅棗果實(shí)。樣品清洗干凈后，自然晾曬至含水量35%左右并進(jìn)行冷凍干燥。凍干的樣品經(jīng)過研磨，篩分（40目），真空密封包裝并于-18℃條件下儲(chǔ)藏備用，紅棗樣品名稱及編號見表1。

表1 紅棗樣品名稱及編號Table 1 The varieties and numbers of jujube

有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品（草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸）：Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；磷酸二氫銨、鹽酸（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）、Pacific RO純水儀：美國賽默飛世爾公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；ML204電子天平：梅特勒-托利多科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品混合標(biāo)準(zhǔn)品制備

精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品（草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸），加入超純水分別制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取上述儲(chǔ)備液，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.3.2 方法學(xué)評價(jià)

參照文獻(xiàn)[16-17]的方法，采用線性范圍、檢出限、定量限等指標(biāo)對高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測方法進(jìn)行評價(jià)。

1.3.3 有機(jī)酸的提取

精確稱取2.00 g冷凍干燥的棗粉與80 mL去離子水混合均勻，在45℃條件下，超聲波輔助提取45 min，分離上清液，提取步驟重復(fù)3次，合并上清液減壓蒸干，用超純水定容至15 mL，過0.45 μm膜，收集濾液。

1.3.4 有機(jī)酸的測定

采用高效液相色譜法測定有機(jī)酸組成，檢測器為二極管陣列檢測器，色譜柱為Agilent AQ柱（250 mm×4.6 mm，5μm），檢測波長210 nm，流動(dòng)相為磷酸二氫銨溶液（10 mmol/L，pH2.55），流速 0.5 mL/min柱溫 30℃，進(jìn)樣量10μL。采用外標(biāo)法定量，濃度表示為mg/100g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均平行測定3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。采用Origin 2019軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，PCA和HCA分析采用Matlab 2018軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和方法學(xué)評價(jià)

采用HPLC法得到的7種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1所示。

圖1 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC profile of mixed standard of organic acids

由圖1可知，在試驗(yàn)條件下，7種有機(jī)酸在20 min內(nèi)得到了較好的分離。對7個(gè)混標(biāo)梯度進(jìn)行檢測，將峰面積（y）與濃度（x）進(jìn)行線性擬合并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對所建立的方法進(jìn)行評價(jià)，方法學(xué)評價(jià)參數(shù)結(jié)果如表2所示。

表2 方法學(xué)評價(jià)參數(shù)結(jié)果Table 2 The results of methodological evaluation parameters

由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9～1.000 0，線性良好；檢出限 0.055 μg/mL～1.010 μg/mL，定量限 0.194 μg/mL～3.350 μg/mL，加標(biāo)回收率 98.21%～101.19%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均小于5%，說明該方法精密度和準(zhǔn)確度良好，可以用于紅棗樣品中有機(jī)酸的檢測。

2.2 不同品種紅棗中有機(jī)酸的含量

對99個(gè)品種紅棗中有機(jī)酸種類和含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同品種紅棗中有機(jī)酸種類及含量Fig.2 The varieties and contents of organic acids in different samples

由圖2可知，不同品種紅棗的有機(jī)酸種類和含量

差異較大，99個(gè)品種有機(jī)酸的總含量為19.48 mg/100 g（96號，金絲新4號）～128.92mg/100g（10號，舊莊窩棗），平均值為55.23mg/100g。所有樣品中均檢測出了蘋果酸和奎寧酸，蘋果酸含量為1.64 mg/100 g（49號，骨頭棗）～73.44 mg/100 g（10號，舊莊窩棗），奎寧酸含量為0.20 mg/100 g（87號，新鄭紅1號）～75.88 mg/100 g（60號，金絲1號）。

草酸含量最高的是短果長紅棗（99號），含量為3.72 mg/100 g；酒石酸含量最高的是上海百浦棗（53號），含量為40.44 mg/100 g；奎寧酸含量最高的是金絲小棗一號（60號），含量為75.88 mg/100 g；蘋果酸含量最高的是舊莊窩棗（10號），含量為73.44 mg/100 g；馬來酸含量最高的是露脆棗（48號），含量為1.96 mg/100 g；檸檬酸含量最高的是魯棗5號（27號），含量為16.72 mg/100 g；富馬酸含量最高的是長紫脆棗（61號），含量為 29.24 mg/100 g。

暢曉潔[3]研究得到陜西狗頭棗中有機(jī)酸含量為143.5 mg/100 g，以檸檬酸、蘋果酸含量較高；魏婷等[18]研究得到陜西冬棗有機(jī)酸含量為48.53 mg/100 g，以檸檬酸、酒石酸和草酸含量較高；劉啟玲等[19]研究得到山西板棗中有機(jī)酸含量為126.1 mg/100 g，以檸檬酸、草酸和富馬酸含量較高；李棟等[6]研究得到山西8種代表性紅棗品種有機(jī)酸含量范圍為61.5 mg/100 g（稷山板棗）～99.6 mg/100 g（臨猗梨棗），以檸檬酸、草酸和富馬酸含量較高；王慶衛(wèi)等[20]研究得到河北阜平大棗有機(jī)酸含量192.7 mg/100 g，以檸檬酸和蘋果酸含量較高。由此可見，不同品種、不同產(chǎn)地紅棗中有機(jī)酸的種類、含量存在較大差異，這是不同品種紅棗風(fēng)味差異的重要因素之一，其原因可能歸結(jié)于品種、產(chǎn)地土壤條件、氣候以及栽培方式的差異?？傮w上紅棗中有機(jī)酸含量較低，僅為常見水果（桃、杏、蘋果等）的2.5%～10%[21]。

2.3 相關(guān)性分析

采用Pearson相關(guān)性分析法研究了不同有機(jī)酸之間的關(guān)系，結(jié)果如表3所示。

表3 不同品種紅棗有機(jī)酸相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of organic acids in different jujube samples

由表3可知，紅棗中有機(jī)酸總含量與酒石酸、奎寧酸、蘋果酸含量呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與富馬酸呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），表明新疆紅棗中有機(jī)酸主要由酒石酸、奎寧酸和蘋果酸3種組成，這與暢曉潔[3]和王慶衛(wèi)等[20]的研究結(jié)果一致，與魏婷等[18]、劉啟玲等[19]和李棟等[6]的研究結(jié)果略有差異，其原因可能是不同紅棗產(chǎn)地土壤、地域及氣候等條件的差異。此外，檸檬酸含量與草酸含量相關(guān)性極顯著（p＜0.01），奎寧酸與檸檬酸、草酸相關(guān)性顯著（p＜0.05）。其他有機(jī)酸之間相關(guān)性不顯著（p＞0.05）。

2.4 聚類分析

采用HCA方法將紅棗按照有機(jī)酸種類和含量相似程度逐漸聚合在一起，相似度最大的優(yōu)先聚合，最終按照類別的綜合性質(zhì)實(shí)現(xiàn)多個(gè)品種聚合[22]。圖3為99個(gè)品種紅棗的聚類樹狀圖，表4為不同聚類中各種有機(jī)酸含量的平均值。

圖3 99個(gè)紅棗品種HCA分析圖Fig.3 Hierarchical cluster analysis dendrogram of 99 jujube varieties

表4 不同聚類中有機(jī)酸的平均含量Table 4 The mean values of the detected compounds in different clusters mg/100 g

由圖3和表4可知，基于有機(jī)酸含量，99個(gè)品種紅棗被分為5個(gè)聚類。聚類1包括38個(gè)品種，這些樣品中奎寧酸和蘋果酸這兩種最主要的有機(jī)酸含量較低，其平均值分別為12.864 mg/100 g和13.232 mg/100 g，因此其有機(jī)酸總含量也是最少的，平均值為41.564 mg/100 g。聚類2包括14個(gè)品種，其中的酒石酸含量較高，平均含量為23.084mg/100g。聚類3包括4個(gè)品種，與聚類1相反，聚類3中樣品的奎寧酸和蘋果酸平均含量最高，分別為57.94 mg/100 g和27.632 mg/100 g；因此其有機(jī)酸總含量最高，平均值為90.96 mg/100 g。聚類4包括25個(gè)品種，其中樣品的檸檬酸和草酸含量較高，平均值分別為9.348 mg/100 g和1.508 mg/100 g。聚類5包含18個(gè)品種，其樣品中馬來酸和富馬酸含量較高，平均值分別為1.128mg/100g和13.148mg/100g。

2.5 主成分分析

PCA分析可以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的降維，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)集對方差貢獻(xiàn)最大的特征，從而直觀反映研究對象，并對其作出客觀的評價(jià)[23]。本文采用PCA分析研究了不同紅棗品種有機(jī)酸含量的差異性。表5為各主成分方差貢獻(xiàn)率，表6為各主成分因子向量載荷系數(shù)。

表5 各主成分方差貢獻(xiàn)率Table 5 Percentage of variance of each principal component

表6 各主成分因子向量載荷系數(shù)Table 6 Component matrix of principal component analysis of grading indices

由表5可知，前4個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為72.57%。由表6可知，PC1主要與蘋果酸和總有機(jī)酸含量相關(guān)，PC2主要與檸檬酸和草酸含量相關(guān)，PC3主要與酒石酸、奎寧酸和富馬酸含量相關(guān)，PC4主要與馬來酸含量相關(guān)。

圖4為99個(gè)紅棗品種的PCA分析圖。

圖4 99個(gè)紅棗品種的PCA分析圖Fig.4 PCA plot of 99 jujube varieties

圖4A中的數(shù)字代表紅棗樣品編號，圖4B中不同顏色的橢圓代表不同聚類的95%置信橢圓，若兩個(gè)橢圓之間沒有交集，說明兩個(gè)聚類組間差異顯著，反之則說明兩個(gè)聚類組間差異不顯著[1]。由圖4B可知，聚類3與聚類4，聚類3與聚類5之間沒有交集，說明其組間差異顯著，這與HCA分析結(jié)果一致：聚類3中的樣品主要有機(jī)酸（如奎寧酸和蘋果酸）和總有機(jī)酸平均含量最高（表4）。其他種群之間都存在交集，因此無法通過PCA分析完全區(qū)分它們。換言之，由于所有樣本均來自同一產(chǎn)地，且栽培條件相似，樣本之間有機(jī)酸含量的差異不足以對所有樣品類群進(jìn)行區(qū)分，但可以在聚類水平上實(shí)現(xiàn)部分樣品的分類。

3 結(jié)論

本文采用HPLC法對新疆99個(gè)品種紅棗中的7種主要有機(jī)酸進(jìn)行了定性定量分析，并進(jìn)一步對不同品種紅棗有機(jī)酸種類和含量的差異進(jìn)行了多元統(tǒng)計(jì)分析。紅棗中共檢測到蘋果酸、奎寧酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸、草酸和馬來酸7種有機(jī)酸，總含量范圍為19.48 mg/100 g～128.92 mg/100 g，其中蘋果酸、奎寧酸和酒石酸是各個(gè)品種紅棗中的主要有機(jī)酸。根據(jù)有機(jī)酸種類和含量，采用HCA將99個(gè)品種紅棗分為5個(gè)聚類；PCA共提取出4個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為72.57%。通過PCA結(jié)合HCA，聚類3和聚類4，聚類3和聚類5有機(jī)酸含量的組間差異顯著。本研究為棗樹的栽培育種、品質(zhì)評價(jià)和產(chǎn)品開發(fā)提供重要數(shù)據(jù)支持。此外，后期利用基因組學(xué)和酶學(xué)等分子生物學(xué)技術(shù)，研究造成不同品種紅棗品質(zhì)差異的分子機(jī)制是十分必要的。