姜越,張宇林，董盈妹,嚴(yán)花,趙霞

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科學(xué)研究所，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

哮喘是兒童時(shí)期常見的慢性疾病之一,以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為主要臨床特點(diǎn)[1]。目前全球哮喘患者有3億左右,其中兒童約占三分之一,我國(guó)是哮喘病死亡率較高的國(guó)家。我國(guó)完成的第3次兒童哮喘流行病學(xué)研究顯示,我國(guó)兒童哮喘的患病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[2]。

吸入糖皮質(zhì)激素等是西醫(yī)防治哮喘的主要手段[3]。有研究表明,糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期使用給哮喘患者帶來(lái)的副作用相比安慰劑而言要明顯很多,而且還存在對(duì)其不敏感的難治型患者[4-5]。中醫(yī)藥防治哮喘在多年臨床應(yīng)用中獲得廣泛認(rèn)可,固本防哮飲是我國(guó)著名中醫(yī)兒科專家江育仁教授的經(jīng)驗(yàn)方,臨床研究表明其防治哮喘療效突出[6]。課題組前期研究證實(shí),固本防哮飲可有效減輕哮喘緩解期小鼠氣道炎癥[7],降低氣道高反應(yīng)性,改善小鼠肺功能[8]。

近年來(lái)研究表明,在哮喘復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中,上皮損傷因素是不可忽視的誘因之一,哮喘患者氣道上皮屏障完整性受損已被證明確實(shí)存在,即“缺陷上皮”假說(shuō)[9]。從修復(fù)哮喘患者受損氣道上皮屏障功能方面探討固本防哮飲防治哮喘的作用機(jī)制十分必要,故本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究固本防哮飲對(duì)哮喘緩解期小鼠氣道上皮緊密連接蛋白和CCSP的作用,探討固本防哮飲對(duì)氣道上皮屏障完整性的修復(fù)作用及其防治哮喘的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性Balb/c小鼠36只,4～6周齡,體質(zhì)量16～18 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,本研究經(jīng)由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理號(hào):202012A054。

1.2 藥物

孟魯司特鈉片:10 mg·片-1,購(gòu)自杭州默沙東藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):K004567。固本防哮飲:炙黃芪15 g，黨參10 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，煅牡蠣15 g，蟬蛻6 g，陳皮6 g，防風(fēng)3 g，辛夷6 g，五味子6 g，生甘草3 g,以上11味藥材購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院。藥物浸泡于10倍量冷水中30 min,煎30 min后濾出;第2煎取8倍量水煎30 min后濾出,合并2次藥液,使用旋蒸儀濃縮至生藥含量3 g·mL-1,密封4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器

卵蛋白(OVA,批號(hào):326A058),美國(guó)Sigma公司;兔抗小鼠橋粒芯膠蛋白(Desmocollin)抗體(批號(hào):MAB7367-SP)、兔抗小鼠閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)抗體(批號(hào):bs-1329R)、兔抗小鼠閉合蛋白(Occludin)抗體(批號(hào):ARG40500)、山羊抗兔多克隆二抗(批號(hào):ab6721),美國(guó)Abcam公司;鼠抗β-actin抗體(批號(hào):YM1206),美國(guó)ImmunoWay公司;小鼠CCSP ELISA試劑盒(批號(hào):F9206-A);BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào):23227),美國(guó)Thermo Scientific公司;DEPC水(批號(hào):R0021)、蘇木精-伊紅(HE)染色液(批號(hào):C0105)、RIPA裂解液(批號(hào):P0013B),南京碧云天生物技術(shù)有限公司;總RNA提取試劑盒(批號(hào):9109)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):RR306A)、Real-time PCR定量試劑盒(批號(hào):RR820A),加拿大ABM公司。

ChemiDocTMMP化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)Bio-Rad);PowerPac Basic電泳儀(美國(guó)Bio-Rad);Trans-Blot半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad);Infinite 200 pro酶標(biāo)儀(瑞士Tecan);Biophotometer蛋白核酸分析儀(德國(guó)Eppendorf)；PCR逆轉(zhuǎn)錄儀(德國(guó)eppendorf);Quantstudio 7 Flex PCR系統(tǒng)(美國(guó)Life technologies)。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

參照課題組前期造模方法[10]。36只小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、固本防哮飲低劑量組、固本防哮飲中劑量組、固本防哮飲高劑量組、孟魯司特鈉組,每組6只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,第1天和第8天給正常組以外的小鼠予0.2 mL OVA致敏液腹腔注射;從第15天起,每天給予2.5%OVA溶液霧化吸入,每日1次,每次30 min,共14 d。隨后在第32、35、38、41、45、48、51、54天以同樣的方法霧化激發(fā)。在第29、42、55天時(shí)予RSV 50 μL滴鼻。

從第56天開始,正常組、模型組給予雙蒸水20 mL·kg-1灌胃,固本防哮飲低、中、高劑量組分別給予12、24、36 g·kg-1固本防哮飲灌胃,孟魯司特鈉組給予孟魯司特鈉2.6 mg·kg-1灌胃,每日1次,共28 d。末次給藥后24 h,麻醉脫頸椎處死小鼠,收集樣本。實(shí)驗(yàn)共84 d。

2.2 取材

處死小鼠,結(jié)扎小鼠右肺,使用0.5 mL PBS對(duì)小鼠左肺進(jìn)行灌洗,重復(fù)3次,收集3次支氣管肺泡灌洗液(BALF),4 ℃ 1 000 r·min-1離心10 min,收集上清液,分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。取右肺中葉浸泡于4%多聚甲醛中固定,用于制備肺組織石蠟切片,未使用的右肺組織,置-80 ℃冰箱凍存,待測(cè)。

2.3 肺組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)

制備小鼠肺組織石蠟切片,進(jìn)行HE染色,觀察血管及氣道周圍炎癥浸潤(rùn)情況。炎癥評(píng)分方法參考文獻(xiàn)[10]:0級(jí)=無(wú)炎癥;1級(jí)=偶爾出現(xiàn)炎癥細(xì)胞;2、3和4級(jí)表明大多數(shù)支氣管或血管分別被薄的1～2細(xì)胞層、中等的3～5細(xì)胞層或厚(>5)的炎癥細(xì)胞層包圍。使用免疫組化檢測(cè)試劑盒,觀察ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表達(dá)及分布情況。隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野,Image J軟件統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性染色面積。

2.4 Western blot檢測(cè)肺組織ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表達(dá)

每組稱取10～15 mg肺組織,加入裂解液,充分研磨,冰上裂解30 min,轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管,4 ℃ 13 000 r·min-1離心30 min,取上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度,蛋白濃度設(shè)定為2 μg·μL-1,加水、上樣緩沖液、樣本,混勻,100 ℃預(yù)熱5 min進(jìn)行蛋白變性,冰盒上冷卻后-20 ℃?zhèn)溆?。配?0%分離膠和5%積層膠,加樣,電泳;電泳后濕轉(zhuǎn)膜;轉(zhuǎn)膜后置搖床上用奶粉封閉1 h,用1×TBST洗膜3次,每次10 min,分別加入按1∶5 000、1∶5 000、1∶3 000比例稀釋好的ZO-1、Occludin、Desmocollin一抗,4 ℃過(guò)夜;洗膜同前,常溫下在搖床上孵育二抗1 h,洗膜同前,配制曝光液,上機(jī),曝光。用Image J軟件處理各條帶,將目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 qPCR檢測(cè)肺組織ZO-1、ZO-2、紐帶蛋白(Vinculin)、連環(huán)蛋白(Catenin)mRNA表達(dá)

按照總RNA試劑盒步驟抽提肺組織RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度及濃度。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,所得cDNA存于-20 ℃冰箱中備用。擴(kuò)增步驟參照試劑盒進(jìn)行。結(jié)果以內(nèi)參GAPDH進(jìn)行校準(zhǔn),采用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表1 qPCR引物序列

2.6 ELISA法檢測(cè)CCSP表達(dá)水平

稱取10～15 mg的肺組織,按體積加入PBS,使用研磨儀充分研磨,4 ℃ 15 000×g離心取上清液,使用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度,終濃度定為3 μg·μL-1。分別檢測(cè)小鼠BALF和肺組織勻漿中的CCSP的表達(dá)水平,具體操作參照小鼠CCSP ELISA試劑盒說(shuō)明書。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組肺組織病理觀察

肺組織病理結(jié)果顯示,模型組肺組織病理?yè)p傷程度較正常組明顯加重,支氣管及其血管周圍伴行以嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞為主的多灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn),同時(shí)可見血管及支氣管壁增厚。與模型組比較,固本防哮飲各劑量組及孟魯司特鈉組小鼠肺組織病理?yè)p傷情況得到改善,同時(shí)血管及支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕,其中固本防哮飲中、高劑量組效果顯著(P<0.05,P<0.01)。見圖1。

注:與正常組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05,##P<0.01。±s,n=3。

3.2 各組肺組織ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,模型組中ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表達(dá)水平較正常組均下降,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比,固本防哮飲各劑量組中ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表達(dá)水平均顯示出不同程度的上調(diào),固本防哮飲中劑量組中ZO-1、Desmocollin蛋白表達(dá)具有顯著性差異(P<0.05,P<0.001),固本防哮飲高劑量組中Desmocollin蛋白表達(dá)具有顯著差異(P<0.001),固本防哮飲低劑量組中Occludin蛋白表達(dá)具有顯著差異(P<0.05),孟魯司特鈉組、固本防哮飲各劑量組間比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖2。

注:與正常組相比,*P<0.05,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05,###P<0.001?！纒,n=3。

免疫組化結(jié)果顯示,ZO-1、Occludin、Desmocollin在正常組小鼠肺組織上皮細(xì)胞和胞漿中大量表達(dá),且排列緊密、有序；模型組中3種蛋白的表達(dá)量明顯減少(P<0.01,P<0.001),排列松散、無(wú)序。與模型組相比,固本防哮飲各劑量組及孟魯司特鈉組中Occludin、Desmocollin的表達(dá)量均顯著回調(diào)(P<0.001),固本防哮飲中劑量組中ZO-1表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，排列漸趨有序、緊密。結(jié)果見圖3。

3.3 肺組織中的ZO-1、ZO-2、Vinculin、Catenin mRNA表達(dá)

模型組中ZO-1、ZO-2、Vinculin、Catenin mRNA表達(dá)水平較正常組均顯著下降(P<0.05，P<0.01);與模型組相比,固本防哮飲高劑量組中上述指標(biāo)的mRNA水平均顯著上調(diào)(P<0.05);孟魯司特鈉組、固本防哮飲各劑量組間比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 肺組織中ZO-1、Vincullin、Catenin、ZO-2 mRNA表達(dá)(±s,n=3)

3.4 肺組織及BALF中CCSP的表達(dá)

與正常組相比,模型組BALF和肺組織中CCSP表達(dá)水平均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);固本防哮飲各劑量組與模型組相比,BALF及肺組織中CCSP的表達(dá)呈上升趨勢(shì),其中固本防哮飲低、高劑量組CCSP的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.001)。孟魯司特鈉組、固本防哮飲各劑量組間比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖4。

注:與正常組相比,**P<0.01;與模型組相比,#P<0.05,###P<0.001。±s,n=3。

4 討論

哮喘氣道的慢性炎癥由多種組織參與并伴有細(xì)胞異常堆積和/或募集,以嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞(AEC)、氣道平滑肌細(xì)胞等常見[11]。其中AEC是抵御各種過(guò)敏原和致病因素的第一道防線。有研究證實(shí)哮喘患者上皮功能存在普遍的缺陷,這種缺陷會(huì)進(jìn)一步加重哮喘氣道的損傷、炎癥反應(yīng)、氣道重塑的表現(xiàn)[12]。因此有學(xué)者認(rèn)為哮喘的發(fā)病和預(yù)后與氣道上皮持續(xù)損傷以及隨后的支氣管上皮細(xì)胞修復(fù)不當(dāng)密切相關(guān)[13]。修復(fù)損傷的上皮細(xì)胞屏障作用及功能,有助于哮喘的預(yù)防與恢復(fù)。

AEC的基本結(jié)構(gòu)包括具有纖毛結(jié)構(gòu)的纖毛細(xì)胞、具有分化修復(fù)功能的基底細(xì)胞、具有分泌功能的Club細(xì)胞(過(guò)去稱作Clara細(xì)胞)和杯狀細(xì)胞以及少量的刷細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,AEC間存在由緊密連接(TJs)、半橋粒和黏附連接(AJ)等構(gòu)成的多種連接結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)形成物理屏障并維持細(xì)胞的極性[14]。TJs位于相鄰上皮間細(xì)胞內(nèi)連接復(fù)合體的最上緣,在細(xì)胞周圍形成保護(hù)環(huán),主要成分包括:Occludin、claudin、閉鎖小帶蛋白(ZOs)和連接黏附分子(JAMs)[15-16]。TJs中首批被發(fā)現(xiàn)的蛋白是Occludin蛋白,它與ZO-1、ZO-2在維持肺泡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和通透性中相輔相成。但TJs對(duì)于細(xì)胞間隙的封閉作用并不是絕對(duì)的,在上皮細(xì)胞的側(cè)面和緊密連接的下方有一種連續(xù)的帶狀A(yù)J,Catenin是AJ形成的關(guān)鍵成分,與鈣黏蛋白E(E-cadherin)共同參與細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程,與Desmocollin相連,在細(xì)胞間形成致密的骨架網(wǎng)絡(luò)。以上結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成緊密完整的上皮屏障,有效阻隔過(guò)敏原等致病因素。研究表明,過(guò)敏原可以誘導(dǎo)哮喘患者的氣道上皮損傷和屏障功能障礙,同時(shí)下調(diào)幾種TJ和AJ蛋白[17-18]。因此AEC間連接結(jié)構(gòu)完整性的缺陷或功能紊亂會(huì)成為誘導(dǎo)哮喘發(fā)生的直接導(dǎo)火索。

CCSP具有抗炎、抗纖維化的作用,是重要的內(nèi)源性抗炎因子,在Club細(xì)胞特異性表達(dá)中占據(jù)標(biāo)志性的地位,它在維持遠(yuǎn)端呼吸道上皮完整性和修復(fù)上皮黏膜損傷中起重要作用[19-20]。研究表明Club細(xì)胞是氣道上皮損傷修復(fù)的干/祖細(xì)胞,CCSP可通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞遷徙,降低磷脂酶A2(Pla2)活性,減少白三烯(LT)產(chǎn)生,從而預(yù)防哮喘氣道重塑的發(fā)生[21]。有學(xué)者前期研究表明,在OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中,Club細(xì)胞的增殖可隨糖酵解途徑的中斷而停滯,這會(huì)大大減緩氣道上皮損傷后炎癥消退的進(jìn)程[22]。臨床研究表明，哮喘急性發(fā)作期兒童CCSP的水平明顯低于健康兒童[23]。綜上均說(shuō)明CCSP對(duì)哮喘氣道上皮炎癥損傷、呼吸道重塑等具有關(guān)鍵的保護(hù)作用。

固本防哮飲是江蘇省中醫(yī)院江育仁教授在“扶正固本”思想的指導(dǎo)下,由玉屏風(fēng)散和異功散加減而來(lái),方中黃芪為君藥，行補(bǔ)肺固表止汗之功；黨參、白術(shù)、茯苓、陳皮同為臣藥；防風(fēng)、辛夷、蟬蛻、五味子為佐藥; 煅牡蠣、生甘草為使藥。益氣固表，健脾助運(yùn)，標(biāo)本兼顧，祛邪不傷正，共奏補(bǔ)肺固表，健脾化痰之功。有課題組通過(guò)臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),使用固本防哮飲聯(lián)合平喘敷貼治療哮喘緩解期兒童的臨床有效率高于使用布地奈德福莫特羅粉吸入劑以及沙丁胺醇?xì)忪F劑[24]。同時(shí)有研究證實(shí),固本防哮飲中的君藥黃芪的主要成分黃芪甲苷,可以抑制TNF-α和ORMDL3過(guò)表達(dá)所引起的Sphk1的激活,減輕上皮細(xì)胞屏障功能的損傷,進(jìn)而達(dá)到緩解炎癥,防治哮喘的目的[25]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)固本防哮飲干預(yù)的哮喘緩解期小鼠肺組織病理?yè)p傷較模型組明顯減輕,血管及支氣管周圍炎癥浸潤(rùn)情況好轉(zhuǎn),其中固本防哮飲中、高劑量組療效顯著，提示固本防哮飲具有減輕哮喘緩解期小鼠肺組織炎癥的作用。此外,模型組中ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表達(dá)較正常組均出現(xiàn)不同程度的下調(diào),固本防哮飲各劑量組中ZO-1、Occludin、Desmocollin蛋白表達(dá)水平呈回調(diào)趨勢(shì)；同時(shí)模型組中ZO-1、ZO-2、Vinculin、Catenin mRNA 的表達(dá)較正常組顯著降低，而固本防哮飲可以增加ZO-1、ZO-2、Vinculin、Catenin的mRNA表達(dá)水平。以上結(jié)果均說(shuō)明固本防哮飲可能對(duì)哮喘緩解期小鼠氣道上皮緊密連接結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用。同時(shí)固本防哮飲可以上調(diào)哮喘緩解期小鼠BALF及肺組織中CCSP的表達(dá)，這可能是其修復(fù)損傷上皮,恢復(fù)上皮屏障完整性,減輕哮喘慢性氣道炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

因此,固本防哮飲可能是通過(guò)恢復(fù)氣道上皮緊密連接結(jié)構(gòu)和滲透性,修復(fù)受損上皮屏障,減少過(guò)敏原及病毒微生物等的侵入,從而達(dá)到防治哮喘的功效,這也是對(duì)于中醫(yī)“固表”理論內(nèi)涵的闡述。但緊密連接蛋白在固本防哮飲防治哮喘作用機(jī)制中扮演的具體角色需要進(jìn)一步研究。