余平，狄冉，江炎庭，楊紅遠(yuǎn)，洪瓊花※，儲(chǔ)明星※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224）

山羊（Capra hircus）作為最古老的家養(yǎng)動(dòng)物之一，也是世界上最重要的畜牧業(yè)品種之一，能為人類(lèi)提供穩(wěn)定的肉、奶和毛皮等生活物資，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)重要地位[1]。我國(guó)山羊品種多、存欄量大，但繁殖力低、生長(zhǎng)速度慢等因素依然長(zhǎng)期制約著山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2]。山羊產(chǎn)羔性狀即產(chǎn)羔數(shù)和窩重情況（初生窩重和斷奶窩重）作為衡量母羊生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)，與群體的繁衍速度和規(guī)模密切相關(guān)，是山羊生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟(jì)性狀，直接影響著養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。但羊產(chǎn)羔數(shù)性狀受外界因素影響較大，遺傳力很低，山羊僅為0.14 左右[3,4]，因此通過(guò)相關(guān)候選位點(diǎn)的發(fā)掘等方法和尋找更有效、更關(guān)鍵的分子標(biāo)記，對(duì)山羊進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，進(jìn)而提高山羊產(chǎn)羔數(shù)等性狀具有重要現(xiàn)實(shí)意義[5]。

乙酰膽堿（ACh）是主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，其受體分為兩種，即煙堿型受體（nAChRs）和毒蕈堿型受體（mAChRs）。nAChRs是介導(dǎo)突觸間快速信號(hào)傳遞的五聚體配體門(mén)控離子通道，由 和 跨膜亞基構(gòu)成的不同組合組成[6]，不同的亞單位構(gòu)成不同的亞型，同時(shí)也表現(xiàn)出不同的生理學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)。目前已經(jīng)確認(rèn)有5 種具有不同功能的nAChR 亞型存在，7 亞型作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布最為廣泛的亞型之一，也是最為特殊的一個(gè)，它由定位于15 號(hào)染色體長(zhǎng)臂14 區(qū)（15q14）、全長(zhǎng)185 kb[7]的CHRNA7 基因編碼，由5 個(gè)相同的亞基構(gòu)成，也稱(chēng)為CHRNA7，具有高鈣離子通透性[8]。盡管CHRNA7 的分布與其他nAChRs 亞型有很大的重疊，但其分布是最廣泛的，在下丘腦、海馬和丘腦等區(qū)域有比較密集的分布，在紋狀體、前腦、髓質(zhì)和各種腦核中的分布則比較稀疏[9]，同時(shí)，其在神經(jīng)、免疫、循環(huán)、呼吸及生殖系統(tǒng)中也可以檢測(cè)到[10]-晶體蛋白（CRYM，也稱(chēng)為“M-Crystallin”M-晶體素）是一種種屬特異性的35-KDA蛋白，在袋鼠晶狀體中大量表達(dá)[11]，亦在人視網(wǎng)膜、腦、心臟和腎臟中高度表達(dá)。Southern印跡分析表明編碼CRYM mRNA 和-結(jié)晶蛋白的基因位于人類(lèi)基因組的16p12.2，在小鼠中位于7QF2[12]。CRYM 是胞質(zhì)中依賴(lài)于NADPH 的甲狀腺激素結(jié)合蛋白，其酮亞胺還原酶可以改變甲狀腺素（TSH）在細(xì)胞中的濃度，甲狀腺激素是基因表達(dá)和代謝的必要調(diào)節(jié)因素，在體內(nèi)生理調(diào)節(jié)中具有重要作用，酮亞胺還原酶作為參與氨基酸代謝的酶類(lèi)，也具有調(diào)節(jié)其他激素和小分子活性的功能，進(jìn)而能影響多種生理進(jìn)程，其精確調(diào)控對(duì)于維持穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)不同的環(huán)境條件至關(guān)重要[13]。Tao L 等[14]的研究結(jié)合基因組方法，鑒定了一些包括CRYM 在內(nèi)的參與山羊卵巢功能調(diào)節(jié)和季節(jié)性繁殖相關(guān)的候選基因，有助于對(duì)山羊繁殖性狀遺傳構(gòu)成進(jìn)行綜合評(píng)估。所以我們猜測(cè)CHRNA7 和CRYM 基因與羊的繁殖性能有關(guān)系。

云上黑山羊是以云嶺黑山羊?yàn)槟副?、努比山羊（黑色個(gè)體）為父本進(jìn)行雜交選育，并采用胚胎移植等繁育新技術(shù)，經(jīng)過(guò)20 多年培育而成的我國(guó)第1 個(gè)肉用黑山羊品種[15]，具有肉質(zhì)鮮美、生長(zhǎng)快及母羊四季均可發(fā)情且產(chǎn)羔率較高等優(yōu)點(diǎn)；濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊也是繁殖能力較強(qiáng)、包含豐富遺傳資源的山羊品種，具有繁殖選育的潛力。本研究選用這3 個(gè)山羊群體作為研究對(duì)象，旨在分析CHRNA7 基因和CRYM 基因在3 個(gè)山羊群體中的遺傳多態(tài)性及其與產(chǎn)羔性能的關(guān)聯(lián)，以期為山羊分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和表型記錄

本研究對(duì)768 只2~5 歲的母羊（云上黑山羊544只、濟(jì)寧青山羊133 只和遼寧絨山羊91 只）頸靜脈血液（10 mL/只）進(jìn)行了采集，并通過(guò)酚氯仿法提取其基因組DNA。本試驗(yàn)的云上黑山羊來(lái)自云南紅河哈尼族彝族自治州，擁有至少1 胎產(chǎn)羔數(shù)的記錄，其中大部分擁有初生窩重和斷奶窩重（3 月齡）記錄；濟(jì)寧青山羊來(lái)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部濟(jì)寧青山羊保種基地（山東省嘉祥縣）；遼寧絨山羊則選自遼寧絨山羊育種中心（遼寧省遼陽(yáng)市）。濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊沒(méi)有具體產(chǎn)羔數(shù)記錄。本試驗(yàn)中視濟(jì)寧青山羊?yàn)楦叻敝沉θ后w，視遼寧絨山羊?yàn)榈头敝沉θ后w[16]。

1.2 基因分型

利用Sequenom MassARRAY SNP 分型技術(shù)[17]對(duì)CHRNA7 和CRYM 基因候選位點(diǎn)（CHRNA7 g.29127669 G ＞A、CHRNA7 g.29206216 C ＞T、CRYM g.18929936 G ＞A 和CRYM g.18929951 A ＞G）進(jìn)行分型檢測(cè)和分析。每個(gè)分型樣品DNA需要量為 20L，DNA 濃度40~80 ng/L。相關(guān)引物信息見(jiàn)表1。

表1 用于分型的引物Table 1 primers used for typing

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Microsoft Excel 軟件，對(duì)CHRNA7 和CRYM基因4 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)（NE）、雜合度（HE）、多態(tài)信息含量（PIC）和等位基因頻率（Ne）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本研究利用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)并探索候選位點(diǎn)基因型與品種（高繁品種：濟(jì)寧青山羊；低繁品種：遼寧絨山羊）之間的關(guān)系。計(jì)算出產(chǎn)羔數(shù)和窩重的平均數(shù)后，采用單因素方差分析的方法分析基因型的效應(yīng)，采用Tukey 法進(jìn)行多重比較，應(yīng)用IBM SPSS Statistics 統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型對(duì)云上黑山羊基因型與產(chǎn)羔數(shù)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤形式表示，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 CHRNA7 和CRYM 基因多態(tài)性分析

由基因分型結(jié)果（圖1）可知，兩個(gè)基因的4 個(gè)候選位點(diǎn)均存在多態(tài)性。在云上黑山羊、濟(jì)寧青山羊和遼寧絨山羊中，CHRNA7 基因的g.29127669 G ＞A 位點(diǎn)存在AG 和GG 兩種基因型，g.29206216 C ＞T 位點(diǎn)存在3 種基因型，分別是CC、CT 和TT；CRYM 基因的g.18929936 G ＞A 位點(diǎn)存在AG 和GG 兩種基因型，g.18929951 A ＞G 位點(diǎn)存在的兩種基因型為AA 和AG。

圖1 基因分型結(jié)果Fig.1 Genotyping results of genes

群體遺傳學(xué)分析（表2）表明，CHRNA7 基因g.29127669 G ＞A 位點(diǎn)在云上黑山羊、遼寧絨山羊和濟(jì)寧青山羊群體中均為低度多態(tài)（PIC ＜0.25），CHRNA7g.29206216C ＞T 位點(diǎn)在3個(gè)群體中均為中度多態(tài)性（0.25＜PIC＜0.5）；CRYM 基因g.18929936G ＞A位點(diǎn)在云上黑山羊、遼寧絨山羊和濟(jì)寧青山羊3 個(gè)群體中均為低度多態(tài)，CRYM 基因g.18929951 A ＞G位點(diǎn)在濟(jì)寧青山羊群體中為中度多態(tài)，而在云上黑山羊和遼寧絨山羊群體中為低度多態(tài)?？ǚ綑z驗(yàn)表明，CHRNA7 和CRYM 兩個(gè)基因的4 個(gè)候選位點(diǎn)在3個(gè)山羊群體中均處于Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)（P ＞0.05）。

表2 候選位點(diǎn)在3 個(gè)山羊品種中的群體遺傳學(xué)分析Table 2 The population genetic analysis of the candidate loci in three goat breeds

2.2 候選位點(diǎn)與繁殖性能的關(guān)聯(lián)分析

如表3 所示，CHRNA7 基因的g.29127669 G ＞A 和g.29206216 C ＞T 兩個(gè)位點(diǎn)在不同繁殖力品種（JN和LN）中的基因型分布均無(wú)顯著差異（P＞0.05），但CRYM 基因g.18929936 G ＞A 位點(diǎn)在不同繁殖力品種中的基因型分布存在極顯著差異（P ＜0.01），CRYM 基因g.18929951 A ＞G 位點(diǎn)在不同繁殖力品種中的基因型分布也存在著顯著差異（P ＜0.05）。

表3 候選位點(diǎn)基因型與不同繁殖力品種的卡方檢驗(yàn)Table 3 Chi-square test for genotypes of candidate loci and Varieties with different fecundity

對(duì)云上黑山羊基因型與產(chǎn)羔數(shù)等表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果（表4）表明，CHRNA7 基因的g.29127669 G ＞A 和g.29206216 C ＞T 位點(diǎn)及CRYM 基因的g.18929951A ＞G 位點(diǎn)的各基因型對(duì)產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著影響（P ＞0.05）；但CRYM 基因g.18929936 G ＞A 位點(diǎn)AG 型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG 型（P ＜0.05）；所有候選位點(diǎn)的各基因型對(duì)初生窩重均無(wú)顯著影響（P ＞0.05）；但CHRNA7 基因g.29206216 C＞T 位點(diǎn)的CC 型的斷奶窩重顯著高于CT 和TT 型（P＜0.05），CT 型與TT 型的斷奶窩重則無(wú)顯著差異；同時(shí)CRYM 基因g.18929936 G ＞A 位點(diǎn)的AG 型的斷奶窩重也顯著高于GG 型（P ＜0.05）。

表4 CHRNA7 和CRYM 對(duì)云上黑山羊產(chǎn)羔性能的影響（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤）Table 4 Effects of CHRNA7 and CRYM on the lambing performance of Yunshang black goat (mean±standard error)

3 討論

3.1 CHRNA7基因多態(tài)性與動(dòng)物繁殖性能的關(guān)系

nAChR 是一種內(nèi)膜蛋白，可結(jié)合神經(jīng)遞質(zhì)煙堿型乙酰膽堿。選擇性的 7nAChR（CHRNA7）配體能識(shí)別煙草的主要成分乙酰膽堿和病理效應(yīng)的關(guān)鍵因子煙堿尼古?。∟T）[18]，由于CHRNA7 分布廣泛，其涉及到眾多功能，包括生長(zhǎng)、突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和免疫應(yīng)答性，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的許多行為起著調(diào)節(jié)作用，也與包括阿爾茨海默癥和帕金森等在內(nèi)的多種疾病有關(guān)系[19]，有研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥相關(guān)的行為會(huì)因提高海馬中 7nA ChR 的含量而得到調(diào)節(jié)，從而認(rèn)為CHRNA7 可能與抑郁癥的發(fā)生存在密切的聯(lián)系[20]。 這些結(jié)果表明，7nAChR有發(fā)展成為治療炎癥、敗血癥、精神分裂癥和認(rèn)知障礙等疾病藥物的潛力[21]。有研究相繼發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中存在 7nAChR[22]，也有越來(lái)越多的研究表明，7nAChR是包括宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥的潛在治療靶點(diǎn)[23]。CHRNA7 是編碼7nAChR 的關(guān)鍵基因，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在不同的非神經(jīng)元細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)[24]。但關(guān)于該基因在山羊繁殖性能方面是否產(chǎn)生影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，CHRNA7 基因g.29127669 G ＞A 位點(diǎn)在云上黑山羊、遼寧絨山羊和濟(jì)寧青山羊群體中均為低度多態(tài)（PIC ＜0.25），CHRNA7g.29206216 C ＞T位點(diǎn)在3個(gè)群體中均為中度多態(tài)性（0.25 ＜PIC＜0.5）；卡方檢驗(yàn)表明，CHRNA7 基因的2 個(gè)候選位點(diǎn)在3 個(gè)山羊群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。云上黑山羊中基因型與產(chǎn)羔數(shù)等表型關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果表明，CHRNA7 基因的g.29127669 G ＞A 和g.29206216 C ＞T 位點(diǎn)各基因型對(duì)產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著影響（P ＞0.05），但g.29206216 C ＞T 位點(diǎn)的CC 型個(gè)體斷奶窩重顯著高于CT 和TT 型（P ＜0.05），CT 型與TT 型的斷奶窩重則無(wú)顯著差異。

3.2 CRYM 基因多態(tài)性與動(dòng)物繁殖性能的關(guān)系

本研究中，CRYM 基因的g.18929936 G ＞A 位點(diǎn)在云上黑山羊、遼寧絨山羊和濟(jì)寧青山羊3 個(gè)群體中均為低度多態(tài)（PIC ＜0.25），g.18929951 A ＞G 位點(diǎn)在濟(jì)寧青山羊群體中為中度多態(tài)（0.25 ＜PIC＜0.5），而在云上黑山羊和遼寧絨山羊群體中為低度多態(tài)?？ǚ綑z驗(yàn)表明，CRYM 基因的2 個(gè)候選位點(diǎn)在3 個(gè)山羊群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。云上黑山羊中的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，CRYM 基因的g.18929951 A ＞G 位點(diǎn)的各基因型對(duì)產(chǎn)羔數(shù)均無(wú)顯著影響（P ＞0.05），但g.18929936 G ＞A 位點(diǎn)AG 型的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG 型（P ＜0.05）；2 個(gè)候選位點(diǎn)的各基因型對(duì)初生窩重均無(wú)顯著影響（P ＞0.05），但g.18929936 G ＞A 位點(diǎn)的AG 型的斷奶窩重也顯著高于GG 型（P ＜0.05）。

4 結(jié)論

CHRNA7 基因的2 個(gè)位點(diǎn)g.29127669 G ＞A 和g.29206216 C ＞T 均不適合作為云上黑山羊產(chǎn)羔性能的分子標(biāo)記，但CHRNA7 基因g.29206216 C ＞T 位點(diǎn)可以用于斷奶窩重的選擇；CRYM 基因g.18929951 A＞G 位點(diǎn)不適合用于產(chǎn)羔性能的選擇，而CRYM基因g.18929936 G ＞A 位點(diǎn)可作為云上黑山羊產(chǎn)羔數(shù)選擇的潛在分子標(biāo)記，同時(shí)也適合斷奶窩重的選擇。