王曉旭，胡盼，鮑坤，趙成新，李光玉※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.煙臺金海藥業(yè)有限公司，山東 煙臺 264010；3.吉林大學(xué)人獸共患病研究所人獸共患病教育部重點實驗室，吉林 長春 130062）

沙門氏菌是重要的人畜共患病病原菌，目前報道的血清型已超過2 500 個，呈全球性分布。禽沙門氏菌病是由沙門氏菌屬一個或多個成員所引起的急性或慢性傳染病，臨床上多表現(xiàn)為敗血癥和腸炎等。雞白痢沙門氏菌是其中的一員，不同品種、不同日齡的雞均可感染。在我國，雞白痢沙門氏菌病是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的傳染病之一[1,2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，雞白痢沙門氏菌引起的感染逐年増加，而且雞白痢沙門氏菌的耐藥性越來越強，這與過量使用抗生素有直接關(guān)系，目前已引起各國的廣泛關(guān)注[3,4]。因此，有效抑制沙門氏菌，尋找抗生素替代品成為各國研究的新方向。各種天然抗菌物質(zhì)中，有機酸抑菌效果優(yōu)良、性質(zhì)穩(wěn)定及價格低廉在一定范圍內(nèi)使用不易產(chǎn)生耐藥性、不影響飼料的適口性等特性，逐漸引起各國學(xué)者的廣泛關(guān)注[5,6]。目前國內(nèi)外關(guān)于酸化劑對雞白痢沙門氏菌抑菌作用的研究較少，本實驗通過不同濃度金立酸對雞白痢沙門氏菌抑制效果的分析和評價，為生產(chǎn)中雞白痢沙門氏菌的有效控制提供了新的技術(shù)，并為酸化劑作為新型抗生素替代品在抑菌中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 雞白痢沙門氏菌購于美國模式菌種收集中心（ATCC）。由于本章中所用菌株均為Salmonella pullorum ATCC10398 株，本章的相關(guān)描述中均用沙門氏菌作為簡稱。

1.1.2 酸化劑 酸化劑由煙臺金海藥業(yè)有限公司研發(fā)并生產(chǎn)，商品名為金立酸。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 恒溫培養(yǎng)箱（上海實驗儀器總廠）、超低溫冰柜（日本，SANYO 公司）、高速冷凍離心機（日本，KUBOTA 公司）、水浴搖床（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)有限公司）、可調(diào)式恒溫水浴箱（美國，HUBER 公司）、接種環(huán)、濾膜、試管、試管塞、培養(yǎng)皿、玻璃瓶、L 棒及小濾器等。

1.1.4 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自O(shè)XOID 公司，其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。蛋雞產(chǎn)蛋期濃縮飼料購于鐵嶺輝發(fā)農(nóng)業(yè)發(fā)展集團飼料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雞白痢沙門氏菌接種濃度的選擇 參照文獻(xiàn)[7]的方法，在TSA 固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇細(xì)菌，于37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24 h，用平板菌落計數(shù)法計算培養(yǎng)基中細(xì)菌濃度，并將沙門氏菌接種濃度分別調(diào)至105cfu/mL、106cfu/mL 和107cfu/mL。

1.2.2 不同濃度金立酸對沙門氏菌抑制效率的比較

1.2.2.1 金立酸濃度的初步篩選 為了確定金立酸的最佳抑菌濃度，我們調(diào)整金立酸終濃度為100‰、10‰、1‰、0.1‰后與105cfu/mL、106cfu/mL 和107cfu/mL的沙門氏菌共同培養(yǎng)24 h，確定初步抑菌濃度之后，再降低稀釋比例，進(jìn)一步確定其抑菌濃度，之后將不同濃度的金立酸與含有沙門氏菌的蒸餾水和飼料共同培養(yǎng)，每組實驗重復(fù)3 次。

1.2.2.2 金立酸二次濃度篩選和作用時間的確定 根據(jù)初步篩選的結(jié)果，進(jìn)一步細(xì)化抑菌濃度和時間。金立酸與含有沙門氏菌的蒸餾水或飼料共同培養(yǎng)，分別于1 h、2 h、4 h、8 h 和20 h 取與金立酸相互作用的液體1mL，直接在培養(yǎng)皿上進(jìn)行涂布，過夜培養(yǎng)，菌落計數(shù)，檢測沙門氏菌的數(shù)量。

蒸餾水處理：試管中加入10 mL 無菌蒸餾水，調(diào)整酸化劑和沙門氏菌的終濃度分別為10‰、5‰、3.3‰、2.5‰、2‰和105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL。

飼料處理：試管中加入10 g 飼料，調(diào)整酸化劑和沙門氏菌的終濃度分別為10‰、5‰、3.3‰、2.5‰、2‰和105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL，在取樣時，加入10 mL 無菌蒸餾水，充分混勻，取1 mL 涂布計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 接種細(xì)菌濃度的選擇

接種的沙門氏菌在培養(yǎng)16 h后達(dá)到峰值，并保持至40 h，16~40 h 細(xì)菌濃度變化在（2.4~3.0）1012cfu/mL，符合有機酸篩選實驗的需要。選擇105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL 作為后續(xù)實驗的接種濃度。

2.2 酸化劑濃度的選擇

圖1 沙門氏菌的濃度分別是105cfu/mL、106cfu/mL和107cfu/mL，結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h 后，稀釋100‰和10‰ 的金立酸有很好的抑菌效果，培養(yǎng)基澄清；而稀釋1‰和0.1‰的培養(yǎng)基渾濁，其中有大量的細(xì)菌。根據(jù)初步篩選結(jié)果，我們將金立酸細(xì)化濃度調(diào)整在10‰~1‰之間。

圖1 酸化劑稀釋不同濃度的抑菌效果Fig.1 The bacteriostatic effect of acidifier with different concentrations

2.3 不同濃度金立酸對沙門氏菌抑制效率的比較

金立酸細(xì)化后的終濃度分別是10‰、5‰、3.3‰、2.5‰和2‰，因圖片數(shù)量較多，文中只列出培養(yǎng)20 h結(jié)果，其余見圖4。圖2 的結(jié)果表明，在蒸餾水中添加107cfu/mL 的沙門氏菌、不同添加量的金立酸，培養(yǎng)20 h 時，取1 mL 液體進(jìn)行細(xì)菌平板計數(shù)。結(jié)果顯示，所有稀釋倍數(shù)均可使沙門氏菌數(shù)量降低至不可檢測水平。

圖2 稀釋不同濃度酸化劑的抑菌效果Fig.2 The bacteriostatic effect of acidifier with different concentrations

圖4 不同濃度金立酸對沙門氏菌抑制效果的比較Fig.4 The comparison of the inhibitory effect of acidifiers with different concentrations on

圖3 的結(jié)果表明，將107cfu/mL 的沙門氏菌、蛋雞濃縮飼料與不同濃度的金立酸充分混合，培養(yǎng)20 h時，按比例用蒸餾水混勻，取1 mL 液體進(jìn)行細(xì)菌平板計數(shù)。結(jié)果顯示，所有稀釋倍數(shù)均可使沙門氏菌數(shù)量降低至不可檢測水平。

圖3 稀釋不同濃度酸化劑的抑菌效果Fig.3 The bacteriostatic effect of acidifier with different concentrations

3 討論

酸化劑作為安全、綠色的飼料和飲水添加劑在畜禽養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用，研究報道，不同類型酸化劑抑制或殺滅微生物的效果和機理不同[8-12]。一類只能通過解離出的H+降低胃腸道環(huán)境的pH 來達(dá)到間接降低病原菌數(shù)量的作用，如乳酸蘋果酸、檸檬酸及富馬酸等大分子有機酸[13-15]；另一類不但能降低環(huán)境中的pH，還對革蘭氏陰性菌有抑制作用，如甲酸、乙酸和丙酸等小分子短鏈有機酸。

乳酸是通過解離H+間接降低病原菌數(shù)量的，未解離的乳酸分子以自由擴散方式進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，細(xì)菌胞內(nèi)為中性至弱堿性環(huán)境，pH 大于乳酸的pKa，有乳酸分子在菌體內(nèi)解離為H+和ROO-，H+離子由于細(xì)胞膜的選擇透過性不能以自由擴散方式排到菌體外[16]，H+的大量聚集導(dǎo)致菌體內(nèi)pH 下降，為維持菌體內(nèi)正常的pH 環(huán)境，細(xì)菌會消耗ATP 以主動運輸?shù)姆绞綄+泵到菌體外，這一過程需要消耗大量的ATP，從而導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)能效率下降，影響細(xì)菌正常生長和繁殖，甚至導(dǎo)致細(xì)菌衰竭而死亡。降低消化環(huán)境pH 是有機酸在雞飼料中的作用機制之一，通過降低飼料及消化環(huán)境的pH 可刺激消化液分泌，促進(jìn)雞消化器官的發(fā)育，同時破壞致病菌適宜的生存環(huán)境，為益生菌群取得競爭優(yōu)勢并為其生長繁殖創(chuàng)造適宜的酸性環(huán)境[17,18]。金立酸中乳酸的含量在10%左右，主要靠解離H+和降低腸道pH達(dá)到抑菌作用。郭鵬等[19]研究表明，日糧中添加0.2%復(fù)合酸化劑（主要是乳酸）能夠顯著降低消化道前段pH（P ＜0.05），并能提髙十二指腸蛋白酶和淀粉酶的活性。

甲酸、乙酸和丙酸等小分子短鏈有機酸具有不同程度的脂溶性，可與細(xì)胞膜中脂多糖和磷脂分子等成分結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[20]。細(xì)菌外膜組分中脂多糖可阻止抗生素和大分子酶類以自由擴散的方式進(jìn)入胞內(nèi)，而小分子有機酸可通過外膜蛋白孔道進(jìn)入周質(zhì)空間，將磷酸基團和脂多糖羧基質(zhì)子化，從而減弱外膜各組分間互作，外膜蛋白和脂多糖組分的分解破壞了外膜的完整性，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，從而實現(xiàn)抑菌功能[21,22]。young 等[23]研究發(fā)現(xiàn)不同有機酸在初始pH 和摩爾濃度相同情況下，分子量越小的有機酸對李斯特桿菌抑菌效果越顯著。

金立酸的主要成分是乳酸和小分子有機酸，主要成分包含14%甲酸、14%乙酸和2.5%丙酸等。迄今有機酸抑菌作用的分子機制涉及到抑制生物大分子合成、透化細(xì)菌外膜、能量競爭、誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗菌肽和提高胞內(nèi)滲透壓等5 個方面，而且研究的熱點主要集中在小分子有機酸方面。本研究將不同濃度的金立酸與不同濃度沙門氏菌共培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)在蒸餾水中抑菌的效果非常好（主要是模擬生產(chǎn)中以飲水的方式給雞添加金立酸），不同濃度的金立酸均有很好的抑菌效果，而飼料中添加金立酸，高濃度組（10‰ 和5‰）有很好的抑菌效果，中濃度組（3.3‰和2.5‰）共同作用8 h 開始有抑菌效果，低濃度組（2‰）共同作用20 h 開始有抑菌效果。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因尚不清楚，可能是飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)為菌株提供營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)它生長繁殖，同時促進(jìn)細(xì)菌形成某種物質(zhì)增強了其對外界的抵抗力。

4 結(jié)論

總上所述，金立酸對雞白痢沙門氏菌有很好的抑制效果，飼料中添加金立酸，高濃度酸化劑在共培養(yǎng)1h就起到抑菌效果，隨著共培養(yǎng)時間的增加，低濃度酸化劑也起到顯著的抑制效果。飲水中添加金立酸，各個濃度在初始時候?qū)ι抽T氏菌就有良好的抑制效果。