韓秋霞 齊芳 杜洪印

(天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院 天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津 300000)

10%～50%患者術(shù)后持續(xù)疼痛，而丙泊酚是一種常用的全身麻醉藥，用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持，可減少術(shù)后急性疼痛〔1，2〕。丙泊酚作為輔助鎮(zhèn)痛藥的使用仍存在爭(zhēng)議，其在術(shù)后鎮(zhèn)痛中的潛在機(jī)制也大多未知〔3〕。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中樞敏化的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用，引起痛覺過敏和異位痛的發(fā)展〔4〕。NMDA受體包括GluN1和GluN2亞基，后者包括4種類型亞基：GluN2A、2B、2C和2D。GluN2B亞基主要表達(dá)于脊髓背角的椎板Ⅰ突觸，在傷害性信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用〔5〕。研究報(bào)道，足底切口誘導(dǎo)p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化(p-p38MAPK)可增加背根神經(jīng)節(jié)(DRGs)中由環(huán)磷酸腺苷(cAMP)結(jié)合蛋白(EPAC)直接激活的交換蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)傷害性超敏反應(yīng)的發(fā)生〔6〕。EPAC是一種新發(fā)現(xiàn)的cAMP靶蛋白，作為必要的效應(yīng)蛋白，在炎癥和術(shù)后痛覺過敏的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。足底注射EPAC激動(dòng)劑可引起長(zhǎng)期機(jī)械性痛覺過敏〔7〕。研究證實(shí)術(shù)中p-p38MAPK的抑制不僅阻止神經(jīng)元EPAC的表達(dá)和EPAC誘導(dǎo)的痛覺感受器敏化，還可阻斷亞急性術(shù)后疼痛敏感的發(fā)展〔8〕。p38MAPK激活導(dǎo)致神經(jīng)元EPAC表達(dá)增加是導(dǎo)致足底切口或炎癥后長(zhǎng)期傷害性超敏反應(yīng)的關(guān)鍵因素〔9〕。在術(shù)后痛覺過敏中是否激活p38MAPK/EPAC級(jí)聯(lián)的上游分子仍未可知〔10，11〕。本研究探究丙泊酚對(duì)手術(shù)切口后脊髓背角神經(jīng)元p38MAPK/EPAC通路的調(diào)節(jié)作用，以期進(jìn)一步了解丙泊酚對(duì)術(shù)后疼痛的鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠，體重250～300 g，12 h亮/暗循環(huán)，關(guān)在籠子里，自由攝食和飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組 將大鼠隨機(jī)分為3組，空白組(未治療，n=15)、異氟烷組(足底切口全麻，吸入2.5%異氟烷，n=15)、丙泊酚組〔接受足底切口全身麻醉，通過植入導(dǎo)管靜脈輸注丙泊酚至側(cè)尾靜脈，輸注率為1.5 mg/(kg·min)，n=15〕。根據(jù)《動(dòng)物與人劑量轉(zhuǎn)換指南》，用于動(dòng)物的丙泊酚劑量相當(dāng)于維持全身麻醉所需的人體劑量0.2 mg/(kg·min)。異氟烷組或丙泊酚組全身麻醉30 min，足底切口全麻。足底切口后允許30 min恢復(fù)，所有大鼠符合恢復(fù)標(biāo)準(zhǔn)(即恢復(fù)直立反射)。由不參與提供全身麻醉和進(jìn)行足底切口的研究助理(即對(duì)全身麻醉類型盲法)在種植切口前和術(shù)后72 h測(cè)量對(duì)側(cè)和同側(cè)爪子的機(jī)械關(guān)節(jié)痛。

1.2.2術(shù)后急性疼痛模型的建立 通過足底切口手術(shù)建立術(shù)后疼痛模型。在異氟烷或丙泊酚的全身麻醉下，用10%聚維酮碘溶液和75%乙醇消毒右后爪的足底。用11號(hào)刀片作1 cm縱行切口，從距骨末端0.5 cm處開始，一直延伸至足趾，穿過腳掌的皮膚和筋膜。將跖肌挑出并縱向切開，之后借助無菌紗布擦拭肌肉切口位置直至出血停止，縫合大鼠皮膚(借助5-0尼龍線)。術(shù)后將大鼠置于恒溫籠中30 min恢復(fù)。

1.2.3機(jī)械性疼痛的評(píng)估 通過測(cè)量機(jī)械刺激縮足閾值(動(dòng)物對(duì)無害機(jī)械刺激的反應(yīng))評(píng)估機(jī)械對(duì)抗痛。實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于提前準(zhǔn)備好的金屬測(cè)試網(wǎng)上30 min以適應(yīng)環(huán)境。在評(píng)估過程中，一根von Frey纖維(4.31)以連續(xù)的力垂直壓在后腿足底表面的中心，力度至纖維大致彎曲為S形即可。大鼠在3～5 s內(nèi)因刺激而快速縮足或舔爪則被記為陽(yáng)性。若大鼠無反應(yīng)則采用遞增的von Frey纖維進(jìn)行刺激。每只大鼠重復(fù)評(píng)估9次，間隔約5 min。多次重復(fù)的平均值作為最終的機(jī)械刺激縮足閾值。

1.2.4Western印跡 術(shù)后1 h收集L3～L5節(jié)段腰椎背角組織。加入組織裂解液并在冰上研磨組織，之后將組織勻漿置于EP管，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。之后將上樣緩沖液加入蛋白，沸水煮10 min，每孔上樣40 μg。之后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗pan-GluN2B、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2、p38 MAPK、JNK、Epac1/2及對(duì)應(yīng)磷酸化蛋白抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)等，孵育過夜。第2天磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后將膜與二抗山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)在室溫下孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光孵育后，X線片顯示蛋白條帶。用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。

1.2.5免疫熒光染色 戊巴比妥鈉麻醉大鼠，4%多聚甲醛經(jīng)心血管系統(tǒng)灌注。收集腰椎節(jié)段L3～5，置于-80℃保存。之后將組織包埋，截取脊髓組織橫斷面。PBS沖洗組織，3%山羊血清在室溫下封閉1 h，之后將封閉液丟棄，加入一抗兔抗c-Fos(1∶100，Abcam，劍橋，英國(guó))，4℃孵育過夜。PBS洗滌后，切片用熒光標(biāo)記的二抗孵育。二抗孵育結(jié)束后PBS清洗，晾干、封片，之后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1丙泊酚能改善足底切口引起的機(jī)械性疼痛 足底切口可引起大鼠機(jī)械性痛覺敏感。除空白組外，丙泊酚組和異氟烷組的機(jī)械刺激縮足閾值在2 h后顯著降低，之后隨時(shí)間遞增上漲，而丙泊酚組機(jī)械刺激縮足閾值均顯著低于異氟烷組(均P<0.05)。見表1。提示相對(duì)于異氟烷，丙泊酚能顯著改善由足底切口導(dǎo)致的機(jī)械性疼痛。

2.2丙泊酚可抑制足底切口痛模型大鼠脊髓中GluN2B/p-38 MAPK/EPAC1通路相關(guān)因子的蛋白表達(dá) 與空白組比較，異氟烷組和丙泊酚組p-GluN2B/GluN2B、p-p38/p-38、p-ERK/ERK及p-JNK/JNK表達(dá)顯著增加(均P<0.05)。與異氟烷組比較，丙泊酚組p-GluN2B/GluN2B、p-p38/p-38、p-ERK/ERK及p-JNK/JNK表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。見表2。

2.3丙泊酚抑制足底切口痛模型大鼠脊髓c-Fos的表達(dá) 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組相比，異氟烷組和丙泊酚組脊髓背角段(L3～L5)c～Fos陽(yáng)性表達(dá)顯著增強(qiáng)(均P<0.05)。相對(duì)于異氟烷組，丙泊酚組在脊髓背角Ⅰ層表達(dá)顯著被抑制(P<0.05)，在Ⅲ～Ⅴ層的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。表明丙泊酚選擇性地抑制了足底切口痛模型大鼠腰椎背角內(nèi)的傷害性信號(hào)傳遞。見圖1、表3。

圖1 各組c-foss陽(yáng)性細(xì)胞在脊髓背角的分布(免疫熒光染色，×400)

表3 各組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞在脊髓背角的分布層)

3 討 論

據(jù)報(bào)道，在海馬神經(jīng)元中，GluN2B是丙泊酚抑制NMDA受體激活，通過緩慢的鈣離子通道調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流的靶點(diǎn)之一〔12，13〕。研究報(bào)道，丙泊酚通過下調(diào)GluN2B亞基表達(dá)在體內(nèi)抑制鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)〔14，15〕。然而，關(guān)于丙泊酚對(duì)脊髓神經(jīng)元的影響的信息相當(dāng)有限〔16〕。本研究證實(shí)了在動(dòng)物術(shù)后疼痛模型中，脊髓NMDA受體GluN2B亞基是靜脈輸注丙泊酚進(jìn)而減少機(jī)械疼痛的重要靶點(diǎn)。然而，丙泊酚是否通過直接與NMDA受體結(jié)合或間接繞行對(duì)GluN2B產(chǎn)生抑制作用仍有待進(jìn)一步探討〔17〕。

神經(jīng)元中，鈣離子通過NMDA受體進(jìn)而導(dǎo)致MAPK通路激活，脊髓MAPKs的磷酸化，如p38和ERK1/2，參與急性術(shù)后疼痛模型中機(jī)械超敏反應(yīng)的發(fā)生和維持〔18〕。研究表明，在足底切開后1～3 d，脊髓背側(cè)神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中p38 MAPK的磷酸化均有增加，在足底切口前30 min鞘內(nèi)注射p38抑制劑可減輕切口引起的機(jī)械性疼痛〔19，20〕。研究表明，p38 MAPK主要由炎性細(xì)胞因子激活，手術(shù)后損傷的組織會(huì)啟動(dòng)一系列炎癥細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子與術(shù)后疼痛強(qiáng)度呈正相關(guān)〔1〕。

綜上，丙泊酚可降低動(dòng)物術(shù)后疼痛反應(yīng)，抑制脊髓GluN2B-p38MAPK/EPAC1信號(hào)通路。本研究證實(shí)丙泊酚對(duì)脊髓p38 MAPK/EPAC1和c-Fos的表達(dá)選擇性抑制。