李曉璐

腎癌是我國10種最常見的癌癥之一，其中90%是由腎細(xì)胞癌引起的。早期或局部的腎癌患者在接受部分或根治性腎切除術(shù)治療后的5年生存率為92.6%[1]。但是，有近30%的腎癌患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，此時即使患者接受腎切除術(shù)仍會復(fù)發(fā)[2]。盡管可以使用藥物來治療轉(zhuǎn)移性腎癌，但大多數(shù)患者最終仍會死亡。因此，為了獲得更好的腎癌早期診斷、治療策略，迫切需要對腎癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行更深入的探究。微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)在癌癥中的作用已得到世界的普遍認(rèn)可，但仍有部分新發(fā)現(xiàn)的miRNA在生物中的功能有待開發(fā)。miR-136-5p在多種癌癥中的功能均有報道[3]，但是其在腎癌中的功能研究有待豐富。脯氨酰4-羥化酶，β-多肽(Prolyl 4-hydroxylase,β-polypeptide，P4HB)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，其在多種腫瘤中高表達(dá)，參與癌癥的惡性進(jìn)展過程和患者的不良預(yù)后[4]。但是筆者發(fā)現(xiàn)其在腎癌中發(fā)揮功能是否與miR-136-5p存在相關(guān)性尚未清楚。本研究將以腎癌細(xì)胞為研究對象，觀察過表達(dá)miR-136-5p、P4HB對腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，揭示miR-136-5p與P4HB之間的靶向關(guān)系，以期為腎癌的早期診斷、治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 組織樣本來自本院2019年1月至2021年2月行手術(shù)切除的30例腎癌患者的癌組織及正常組織。所有患者及家屬簽署知情同意書。正常腎細(xì)胞(HK2)、腎癌細(xì)胞(ACHN)、786-O、769-P和Caki-1細(xì)胞均購自美國菌種保藏中心；侵襲實驗(Transwell)小室購自美國Corning；細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK8)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HK2、ACHN、786-O、769-P和Caki-1細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為混有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；環(huán)境條件為：5%CO2，95%空氣，飽和濕度的37℃恒溫。每2天傳代1次。

1.2.2 細(xì)胞處理與分組:將組織塊無菌條件下充分研磨，分裝，分別標(biāo)記為正常組織組合癌組織組，-20℃保存?zhèn)溆茫粚⑴囵B(yǎng)48 h的HK2、ACHN、786-O、769-P和Caki-1細(xì)胞分別標(biāo)記為HK2組、ACHN組、786-O組、769-P組和Caki-1組，篩選最合適的細(xì)胞用于實驗研究。將miR-NC、miR-136-5p mimics、pcDNA、pcDNA-P4HB、miR-136-5p mimics+pcDNA、miR-136-5p mimics+pcDNA-P4HB用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染至ACHN細(xì)胞，標(biāo)記為miR-NC組、miR-136-5p mimics組、pcDNA組、pcDNA-P4HB組、miR-136-5p mimics+pcDNA組、miR-136-5p mimics+pcDNA-P4HB組。所有實驗獨立重復(fù)3次，每次做3個重復(fù)。

1.2.3 RT-qPCR實驗:將待檢測的細(xì)胞培養(yǎng)至48 h后，收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，用RT-qPCR試劑盒，檢測其中miR-136-5p、P4HB的表達(dá)情況。所用引物為：miR-136-5p，上游引物ACTCCATTTGTT TTGATGATGGA，下游引物CCAGTGCAGGGTCCGAGGT；P4HB，上游引物GGAATGG AGACACGGCTTC，下游引物TTCAGCCAGTTCACGATG TC；U6、GAPDH為通用引物。所有實驗獨立重復(fù)3次，每次做3個重復(fù)。

1.2.4 CCK8實驗:收集待檢測的細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)至2×105個/ml。取100 μl置于酶標(biāo)板孔中，再加入CCK8溶液充分混合，避光反應(yīng)。結(jié)束后，將酶標(biāo)板置于490 nm波長的酶標(biāo)儀下檢測細(xì)胞的吸光值。細(xì)胞增殖率(%)=OD實驗/OD對照×100%。所有實驗獨立重復(fù)3次，每次做3個重復(fù)。

1.2.5 Transwell實驗:將需要檢測的各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染或培養(yǎng)48 h后，用無血清的DMEM培養(yǎng)基使細(xì)胞饑餓培養(yǎng)12 h。用胰酶消化并用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，以1 000 r/pm離心5 min，除去上清液，再將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至1×105個細(xì)胞/ml。在每個Transwell小室的上層中用含有1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液(100 μl)，在下層中添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(600 μl)，在5%CO2、95%空氣、37℃的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中放置12 h。用甲醇固定、結(jié)晶紫染色后，對遷移、侵襲的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。注意用含有基質(zhì)膠的Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲能力，不含基質(zhì)膠的小室檢測細(xì)胞的遷移能力。所有實驗獨立重復(fù)3次，每次做3個重復(fù)。

1.2.6 熒光素酶報告實驗:將含有野生型(WT或突變體MUT)的miR-136-5p結(jié)合位點的P4HB 3’UTR核苷酸克隆到pGL3熒光素酶報道質(zhì)粒載體。將ACHN細(xì)胞接種在24孔板中，培養(yǎng)24 h，然后將細(xì)胞與WT或MUT報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h后，使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細(xì)胞的熒光素酶活性，完成熒光素酶的測定。所有實驗獨立重復(fù)3次，每次做3個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-136-5p在腎癌組織、細(xì)胞中的表達(dá) 運用RT-qPCR法檢測組織和細(xì)胞中miR-136-5p的表達(dá)情況，與正常組織比較，腎癌組織中 miR-136-5p的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與HK2細(xì)胞比較，ACHN、786-O、769-P、Caki-1細(xì)胞中miR-136-5p的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)?？梢?，miR-136-5p在腎癌中低表達(dá)。見表1、2。

表1 miR-136-5p在腎癌組織中的表達(dá)

2.2 過表達(dá)miR-136-5p對腎癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié) 通過CCK8實驗和Transwell實驗檢測細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，與miR-NC組比較，miR-136-5p mimics組ACHN細(xì)胞中miR-136-5p的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖率、遷移個數(shù)和侵襲個數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見圖1，表3。

表2 miR-136-5p在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 ACHN細(xì)胞的遷移侵襲圖(結(jié)晶紫染色×200)

表3 過表達(dá)miR-136-5p的ACHN細(xì)胞增殖、侵襲

2.3 miR-136-5p靶向P4HB 通過在線預(yù)測網(wǎng)站http://starbase.sysu.edu.cn中預(yù)測到miR-136-5p與P4HB之間存在連續(xù)的6個互補(bǔ)結(jié)合位點。熒光素酶報告實驗顯示，miR-136-5p與P4HB 3’UTR WT之間的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，其他處理組細(xì)胞的熒光素酶活變化不顯著。miR-136-5p與P4HB在腎癌組織中的表達(dá)關(guān)系式為Y=-3.477·X+3.522，二者呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見表4，圖2。

表4 熒光報告基因檢測實驗結(jié)果

圖2 miR-136-5p與P4HB的結(jié)合位點及二者在腎癌組織中表達(dá)的關(guān)系;A miR-136-5p與P4HB存在的互補(bǔ)結(jié)合點；B miR-136-5p與P4HB在腎癌組織中的相關(guān)性

2.4 P4HB在腎癌細(xì)胞中的表達(dá) 與正常組織比較，癌組織中 P4HB的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與HK2細(xì)胞比較，ACHN、786-O、769-P細(xì)胞中P4HB表達(dá)均顯著升高(P<0.05)?？梢?，P4HB在腎癌中高表達(dá)。見表5、6。

表5 P4HB在腎癌組織中的表達(dá)

表6 P4HB在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.5 過表達(dá)P4HB對腎癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)節(jié) 與pcDNA組比較，pcDNA-P4HB組ACHN細(xì)胞中P4HB表達(dá)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量均顯著升高(P<0.05)。見圖3，表7。

圖3 過表達(dá)P4HB的ACHN細(xì)胞遷移侵襲圖(結(jié)晶紫染色×200)

表7 過表達(dá)P4HB的腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲

2.6 過表達(dá)P4HB部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-136-5p對腎癌細(xì)胞增殖侵襲的作用 與miR-NC組比較，miR-136-5p mimics組ACHN細(xì)胞中miR-136-5p的表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量均顯著降低(P<0.05)；與miR-136-5p+pcDNA組比較，miR-136-5p+pcDNA-P4HB組ACHN細(xì)胞中miR-136-5p的表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞增殖率、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量均顯著升高(P<0.05)?？梢?，過表達(dá)P4HB可部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-136-5p對ACHN細(xì)胞增殖、遷移侵襲的調(diào)控作用。見圖4，表8。

圖4 ACHN細(xì)胞的遷移侵襲圖(結(jié)晶紫染色×200)

表8 過表達(dá)P4HB聯(lián)合過表達(dá)miR-136-5p的腎癌細(xì)胞的增殖、侵襲

3 討論

關(guān)于miRNA在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制的研究已成為該領(lǐng)域的熱點。miR-136-5p在多種癌癥中發(fā)揮抑制癌癥惡化的作用，如胃癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、肺癌和腎癌等[5-8]。但是miR-136-5p在腎癌中的功能及調(diào)控機(jī)制的探究仍處于初級階段，有待進(jìn)一步研究。Chen等[9]在對腎癌的研究中報道，與鄰近的非腫瘤組織和細(xì)胞相比，miR-136-5p在腎癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低，說明miR-136-5p還與腎癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡有關(guān)，即miR-136-5p以自身的功能在腎癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮抑制作用，暗示miR-136-5p具有作為腎癌早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物的潛力。Li等[10]在研究中報道，miR-136-5p可作為circTLK1的吸附劑，還可靶向CBX4基因，調(diào)控腎癌細(xì)胞的細(xì)胞表型變化，揭示circTLK1通過吸附miR-136-5p上調(diào)CBX4表達(dá)從而在腎癌的惡性進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，再次證明miR-136-5p在腎癌的發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

本研究檢測了腎癌組織和正常組織、腎癌細(xì)胞和HK2細(xì)胞中miR-136-5p的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-136-5p在癌組織和癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均異常的降低，并且過表達(dá)miR-136-5p后，腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均發(fā)生明顯的抑制，這與Chen等[9]的研究結(jié)果完全一致。進(jìn)一步研究，通過熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，miR-136-5p與P4HB之間存在靶向結(jié)合位點，并且miR-136-5p在腎癌組織中的表達(dá)水平與P4HB的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，推測這可能與miR-136-5p在腎癌中發(fā)揮作用的機(jī)制有關(guān)。

P4HB是脯氨酰4-羥化酶β亞基中的中樞基因之一，屬于蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶家族。P4HB是一種高度豐富的多功能酶，可充當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶以抑制錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集[11,12]。P4HB在多種癌癥中表達(dá)異常升高，與患者的不良預(yù)后、存活率低和放化療抗性有關(guān)[13]，但是其在腎癌中的功能及上有調(diào)控機(jī)制尚未清楚。Xie等[14]研究發(fā)現(xiàn)，P4HB的表達(dá)水平在腎癌組織和腎癌細(xì)胞中存在異常上調(diào)，并且與腎癌患者較差的總體生存率具有明顯的相關(guān)性。

Zhu等[15]報道，P4HB和蛋白在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中的表達(dá)均明顯高于臨近的正常組織，并且這種異常的高表達(dá)還與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。本研究檢測了腎癌組織和腎癌細(xì)胞中P4HB的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，P4HB的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，這與Xie等[14,15]的實驗結(jié)果相吻合。此外，本研究還通過構(gòu)建過表達(dá)P4HB的腎癌細(xì)胞檢測其增殖、遷移、侵襲情況發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)P4HB明顯抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這為探究P4HB在腎癌中發(fā)揮致癌作用的具體機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有助于P4HB用于腎癌的早期診斷、預(yù)后。深入探究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)P4HB還逆轉(zhuǎn)miR-136-5p對腎癌細(xì)胞增殖遷移侵襲的抑制作用。

綜上所述，miR-136-5p抑制腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，產(chǎn)生這種作用的機(jī)制與靶向抑制P4HB有關(guān)，為腎癌的精準(zhǔn)治療提供新的潛在靶點。