房思昌，宋馨，薛玉玲，王世杰,*

1(河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊,050018)2(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海,200093) 3(石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊,050221)

1987年，日本研究者在對(duì)大腸桿菌iap基因測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)了一段異常結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)串聯(lián)間隔重復(fù)。重復(fù)基因由29個(gè)堿基構(gòu)成，非重復(fù)基因由32個(gè)堿基構(gòu)成，在其他原核生物中沒有發(fā)現(xiàn)與其同源的基因序列。由于當(dāng)時(shí)受到科學(xué)技術(shù)的制約及人們認(rèn)識(shí)的匱乏，沒有深入了解其生物學(xué)功能[1]。隨后，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)間隔重復(fù)序列廣泛存在于原核生物基因組和古細(xì)菌中，將它們命名為成簇的規(guī)則間隔短回文序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)，并且發(fā)現(xiàn)CRISPR是可移動(dòng)的序列，在含有CRISPR的原核生物中還發(fā)現(xiàn)了比較保守的基因稱為Cas基因[2]。此外，在化膿鏈球菌(StreptococcuspyogenesSF370)中發(fā)現(xiàn)CRISPR序列的間隔區(qū)與其他菌株中的前噬菌體具有高度的同源性，且噬菌體不能入侵具有相同CRISPR序列間隔區(qū)的古細(xì)菌細(xì)胞，由此推測(cè)CRISPR序列可能對(duì)外源DNA具有特異性免疫功能。

隨著人們對(duì)原核生物基因組分析需求的增加，研究者進(jìn)一步將基因組學(xué)應(yīng)用到細(xì)菌中并闡明其生物學(xué)功能[3]。2007年，BARRANGOU團(tuán)隊(duì)在對(duì)嗜熱鏈球菌基因組分析時(shí)首次證實(shí)了CRISPR系統(tǒng)能夠特異性抵御噬菌體的入侵[4]，2010年以后，CRISPR-Cas系統(tǒng)的功能逐漸明確：由向?qū)NA引導(dǎo)Cas蛋白酶靶向切割外源DNA的特異性免疫系統(tǒng)。CRAWLEY等[5]在對(duì)1 262種乳酸菌基因組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)普遍存在CRISPR免疫功能，其中Ⅱ-A型系統(tǒng)在自身乳酸菌宿主中占主要活性，能夠有效對(duì)外源及宿主DNA進(jìn)行編輯，SANOZKY-DAWES等[6]在對(duì)加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)CRISPR/Cas研究時(shí)發(fā)現(xiàn)存在一種Ⅱ-A型系統(tǒng)，其間隔區(qū)呈現(xiàn)多樣性，證實(shí)了該系統(tǒng)能夠應(yīng)用在乳酸菌中，拉開了應(yīng)用CRISPR進(jìn)行乳酸菌功能解析的序幕。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)

CRISPR-Cas系統(tǒng)由一個(gè)CRISPR基因序列和相對(duì)保守的Cas基因組成，存在于大約83%的古細(xì)菌和45%的細(xì)菌中。CRISPR基因座由前導(dǎo)序列(leader)，重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacer)構(gòu)成。前導(dǎo)序列位于CRISPR基因座上游，長(zhǎng)度為500～700 bp，是CRISPR轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)，重復(fù)序列長(zhǎng)度為28～37 bp，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。間隔序列是從侵入的外源DNA中截取的一小段基因序列，相當(dāng)于將入侵者拉入了“黑名單”，當(dāng)攜帶有此間隔序列的外源DNA再次侵入時(shí)，CRSPR-Cas系統(tǒng)會(huì)進(jìn)行精確的識(shí)別并清除[7]。Cas基因負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄Cas蛋白，Cas蛋白包括Cas1～Cas10等多種蛋白，負(fù)責(zé)間隔序列的獲取和對(duì)外源DNA的防御，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展速度最快且在乳酸菌中應(yīng)用最為廣泛[5]。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)中Cas9蛋白、成熟的CRISPR RNA(crRNA)和tracrRNA、以及原間隔區(qū)相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)是最主要的4種元件，Cas9蛋白包括2個(gè)易于識(shí)別的核酸酶結(jié)構(gòu)域HNH和RUVC，就像兩把剪刀將DNA的兩條單鏈進(jìn)行剪切；crRNA是間隔序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它由RNA內(nèi)切酶Ⅲ(RNaseⅢ)促進(jìn)成熟并與tracrRNA一起形成單向?qū)NA(single guide RNA,sgRNA)，其作用為引導(dǎo)Cas9蛋白到正確的外源DNA切割位點(diǎn)[8]；當(dāng)然，只靠sgRNA的引導(dǎo)作用是不夠的，還需要另一關(guān)鍵因素PAM序列作為特異性的識(shí)別位點(diǎn)，它是位于外源DNA上由NGG(N為任意堿基)3個(gè)堿基組成的小段序列，Cas9復(fù)合物與PAM近端結(jié)合，DNA雙鏈解開[9]。CRISPR-Cas9簡(jiǎn)單免疫流程為：Cas1、Cas2等蛋白對(duì)入侵的外源DNA進(jìn)行剪切并將其一段基因序列放入CRISPR序列中，再次入侵時(shí)CRISPR序列識(shí)別并轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA，2種RNA結(jié)合形成sgRNA與Cas9蛋白形成效應(yīng)復(fù)合物并識(shí)別PAM序列近端雙鏈DNA使其解旋，Cas9核酸酶2個(gè)結(jié)構(gòu)域分別切割形成雙鏈斷裂(double strand break，DSB)(圖1)。隨后出現(xiàn)了Cas9的突變體nickase Cas9(nCas9)與dead Cas9(dCas9)，nCas9又名Cas9切口酶，它與Cas9蛋白的差異在于失活了HNH(Cas9D10A)或RUVC(Cas91840A)結(jié)構(gòu)域，在被單向?qū)NA引導(dǎo)到靶向位置后單一的結(jié)構(gòu)域能夠在靶基因單鏈形成一個(gè)小的缺口而不是DSB，更易實(shí)現(xiàn)斷

圖1 CRISPR-Cas9基因座及免疫流程Fig.1 CRISPR-Cas9 locus and immune process

裂基因的修復(fù)，目前已在干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)中得到了很好的應(yīng)用[10]。dCas9中2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域都失活使其失去雙鏈切割的能力，但依然能夠與雙鏈結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶與靶基因的結(jié)合，成為實(shí)現(xiàn)基因沉默的重要工具，并在植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)中得到良好的應(yīng)用[11-12]。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)分類

CRISPR系統(tǒng)按基因座和Cas蛋白可以分為兩大類(表1)；一類包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型，二類包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型，每種類型因作用位點(diǎn)不同又分為多種亞型，包含標(biāo)志性蛋白來進(jìn)行靶基因的切割，不同的是二類系統(tǒng)使用單一的多結(jié)構(gòu)域蛋白發(fā)揮作用，而一類系統(tǒng)使用大型的多亞基復(fù)合體來進(jìn)行切割，這種大亞基蛋白由CRISPR基因座上的Cas7蛋白形成螺旋骨架連接Cas5并與crRNA緊密結(jié)合，Cas8或Cas10及其他亞基與Cas5連接。一類系統(tǒng)通常由Cas6或Cas5負(fù)責(zé)促使crRNA成熟，二類系統(tǒng)中Ⅱ型系統(tǒng)crRNA的成熟靠RNaseⅢ，Ⅴ、Ⅵ型大部分crRNA成熟分別靠Cas12、Cas13效應(yīng)蛋白的部分核酸酶活性物質(zhì)催化。切割過程中Ⅰ型Cas8負(fù)責(zé)PAM的定位并由Cas3解旋酶切割，Ⅲ型系統(tǒng)通過效應(yīng)復(fù)合物中Cas10的CARF結(jié)構(gòu)域靶向入侵的DNA和RNA，Ⅳ型屬于Ⅰ型與Ⅲ型的衍生物，因缺乏必要的Cas蛋白其潛在的功能還不明確。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型主要通過Cas9、Cas12a、Cas13及相關(guān)結(jié)構(gòu)域HNH、Ruvc、HEPN進(jìn)行剪切[13-14]。在174種乳酸菌的基因組分析中，58個(gè)基因組中發(fā)現(xiàn)了CRISPR序列，其中Ⅱ型系統(tǒng)在鏈球菌和乳桿菌中較為豐富、在副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)中發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型系統(tǒng)的存在，其次是Ⅲ型系統(tǒng)，109個(gè)基因組中未檢測(cè)到CRISPR序列，其他類型如Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型系統(tǒng)在基因組中沒有檢測(cè)到[15]。

受乳酸菌物種差異的影響，可以將其分為內(nèi)源性與外源性CRISPR系統(tǒng)，內(nèi)源性系統(tǒng)指自身存在的完整系統(tǒng)，在嗜熱鏈球菌中較為常見，但因基因組中缺乏非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)而不能得到很好的利用，HIDALGO-CANTABRANA等[21]分析了卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)中內(nèi)源性Ⅰ型系統(tǒng)的作用機(jī)制，并成功實(shí)現(xiàn)了p-gtf(胞外多糖引導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶基因)的敲除，為重新利用內(nèi)源性系統(tǒng)提供了依據(jù)。利用外源性的CRISPR系統(tǒng)是目前有效的方法，可以在一些缺乏完整的CRISPR系統(tǒng)如嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、巴氏乳桿菌(Lactobacilluspasteurii)或含有內(nèi)源性系統(tǒng)的乳酸菌中得到利用，GOH等[22]在利用外源性nCas9系統(tǒng)pLCNICK嗜酸乳桿菌進(jìn)行了基因的敲除和插入，同時(shí)證實(shí)可以在加氏乳桿菌和副干酪乳桿菌中得以利用。

表1 CRISPR-Cas系統(tǒng)分類及作用機(jī)制Table 1 Classification and action mechanism of CRISPR CAS system

3 CRISPR-Cas9在乳酸菌中的應(yīng)用

3.1 基因編輯工具

3.1.1 傳統(tǒng)基因編輯工具

目前已經(jīng)開發(fā)了多種乳酸菌基因編輯技術(shù)：基于質(zhì)粒的同源重組交換技術(shù)、線性DNA重組技術(shù)和基于質(zhì)粒的CRISPR基因編輯技術(shù)。

基于質(zhì)粒的同源重組有單交換和雙交換2種方法，單交換方法指質(zhì)粒與目的基因兩側(cè)的同源序列一次交換實(shí)現(xiàn)基因的敲除與插入，LELOUP等[23]利用pRV300敲除質(zhì)粒在清酒乳桿菌(Lactobacillussake)上通過同源重組單交換置換掉pstⅠ基因及l(fā)acL基因，闡釋了2種基因生物學(xué)存在的意義。但這種方法重組效率低，容易引進(jìn)抗性基因，增加后期篩菌的難度，雙交換的方法利用二次同源交換解決了抗性基因遺留的問題，GROOT等[24]利用雙交換法在植物乳桿菌WCFS1分析了與Mn2+穩(wěn)態(tài)之間的關(guān)系。應(yīng)用2次同源交換剔除單交換插入的目的基因，但這種編輯方法操作繁瑣且耗時(shí)，成本高。

線性DNA重組技術(shù)與基于質(zhì)粒的同源重組技術(shù)原理相同，包含單鏈DNA重組和雙鏈DNA重組，都是利用同源序列進(jìn)行基因組的同源交換，不同的是線性DNA重組技術(shù)不需要構(gòu)建質(zhì)粒，只需在外源重組酶及類似物的輔助線性化為單鏈DNA完成與目的基因的交換，因此不會(huì)引入除目標(biāo)基因以外的其他基因，例如抗性基因，但此項(xiàng)技術(shù)在乳酸菌中并沒有廣泛展開，原因是乳酸菌缺乏輔助該技術(shù)的外源重組酶及類似物[25]。

3.1.2 基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)

基于CRISPR的編輯技術(shù)已經(jīng)成為乳酸菌基因組編輯的強(qiáng)力工具，CRISPR-Cas9的簡(jiǎn)便操作性使其成為分子生物領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)開發(fā)了基于Cas9和Cas9變體的編輯技術(shù)以及與傳統(tǒng)基因編輯工具聯(lián)用的技術(shù)。

CRISPR-Cas9輔助的線性DNA重組技術(shù)在線性重組的基礎(chǔ)上利用了Cas9剪切致死性效果，提高了后期對(duì)野生型菌株的篩選效率。OH等[26]首次在乳酸桿菌中實(shí)現(xiàn)了基于CRISPR編輯的第一個(gè)示例CRISPR-Cas9選擇與單鏈DNA(ssDNA)重組相結(jié)合并成功在羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)ATCC6475中進(jìn)行了編輯。通過SpyCas9靶向野生型序列清除未編輯的細(xì)胞，成功地編輯了基因組中的3個(gè)不同位點(diǎn)，篩選出克隆的效率高達(dá)100%。GUO等[27]首次在乳酸乳球菌NZ900中利用高效外源重組酶Rect優(yōu)化了ssDNA重組，并結(jié)合Cas9反選擇消除未突變野生型菌株，在72 h內(nèi)效率達(dá)到75%以上。ZHOU等[28]在植物乳桿菌WCSF1中利用Cas9線性DNA重組技術(shù)在無抗情況下通過核糖體替換和啟動(dòng)子的點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)了前體途徑，實(shí)現(xiàn)了n-乙酰氨基葡糖的產(chǎn)生。

HUANG等[29]通過RecE/T輔助修復(fù)的Cas9工具，在雙質(zhì)粒系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)植物乳桿菌WCSF1和短乳桿菌ATCC 367單基因敲除，敲除效率為50%～100%，高效修復(fù)雙鏈斷裂。SONG等[10]在干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)中失活Cas9的D10A結(jié)構(gòu)域形成單鏈缺口的Cas9D10A系統(tǒng)，有效繞過DSB的致死性，與前者相比，后者更有效刺激同源重組修復(fù)。SONG等[30]以pLL質(zhì)粒為基礎(chǔ)在乳酸乳球菌NZ9000中開發(fā)了單質(zhì)粒CRISPR系統(tǒng)，經(jīng)過啟動(dòng)子的篩選和單向?qū)gRNA的替換后對(duì)ldh基因進(jìn)行了有效的敲除，敲除效率達(dá)50%。此外，將Cas9結(jié)構(gòu)域同時(shí)失活構(gòu)成的dCas9系統(tǒng)，其中的dCas9蛋白與目標(biāo)基因結(jié)合后失去靶向裂解基因的能力，成為實(shí)現(xiàn)基因沉默和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的強(qiáng)大工具。XIONG等[11]在乳酸乳球菌NZ9000中開發(fā)了基因轉(zhuǎn)錄抑制的雙質(zhì)粒系統(tǒng)，使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pnisin驅(qū)動(dòng)鏈球菌中dCas9的表達(dá)，而強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子P44驅(qū)動(dòng)引導(dǎo)RNA表達(dá)單個(gè)或多個(gè)基因，效率高達(dá)99%，成為基因沉默的重要工具。目前已成功應(yīng)用到大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌和乳酸乳球菌中。一系列Cas9變體的出現(xiàn)成為創(chuàng)造乳酸菌Cas9工具箱新路徑。CRISPR-Cas基因編輯技術(shù)如表2所示。

表2 CRISPR介導(dǎo)的操作技術(shù)Table 2 CRISPR mediated operational techniques

3.2 CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用

3.2.1 功能基因解析

基因編輯是利用一定的手段對(duì)目的基因進(jìn)行刪除、插入和替換的操作技術(shù)。由于Ⅱ型CRISPR-Cas9系統(tǒng)在乳酸菌中占據(jù)多數(shù)，最常用的來源于化膿鏈球菌CRISPR-Cas9(spyCas9)系統(tǒng)已應(yīng)用到干酪乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊式乳桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌中。LEMAY等[33]利用SpyCas9在乳酸乳球菌MG1363中研究噬菌體侵入與細(xì)菌蛋白質(zhì)組成的關(guān)系，通過敲除llmg_0219基因產(chǎn)生了對(duì)p2噬菌體的抗性，揭示了乳酸菌抗性的原因。WANG等[34]利用Spycas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建了植物乳桿菌AR113單、雙、三重bsh(膽鹽水解酶基因)敲除突變體，通過對(duì)4種bsh基因的敲除，利用不同種類的膽汁酸鹽評(píng)價(jià)bsh突變后的菌株耐膽鹽活性，得出bsh1與bsh3對(duì)膽鹽耐受性至關(guān)重要，甘氨酸結(jié)合的膽鹽是bsh的首選底物，為膽汁酸耐受性高的菌株的合理高通量篩選提供了依據(jù)。MYRBR?TEN等[12]利用SpyCas9在植物乳桿菌WCSF1中通過雙質(zhì)粒dCas9系統(tǒng)探索了細(xì)菌生長(zhǎng)過程中Acm2、DnaA和EzrA(細(xì)胞周期基因)相關(guān)蛋白的表達(dá)含量，通過抑制3種基因的細(xì)胞分離蛋白的表達(dá)得出DnaA、EzrA與細(xì)胞的生長(zhǎng)周期有著密切的聯(lián)系。TIAN等[35]利用SpyCas9系統(tǒng)以副干酪乳桿菌NCBIO01-M2ldh(乳酸脫氫酶基因)為靶標(biāo)對(duì)其進(jìn)行敲除和過表達(dá)，篩選出在45 ℃下產(chǎn)量達(dá)221 g/L、光學(xué)與化學(xué)強(qiáng)度達(dá)99%的L-乳酸菌株(表3)。

3.2.2 CRISPR基因座利用

CRISPR間隔物反映了菌株的演變軌跡，當(dāng)菌株被外源噬菌體侵入時(shí)，新的間隔物會(huì)按時(shí)間順序整合到CRISPR序列的前導(dǎo)區(qū)，由于CRISPR-Cas在許多乳酸菌中占據(jù)較高的發(fā)生率，在菌株分型和CRISPR分類方面提供了一定的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)。PUJATO等[37]在49株乳桿菌中分析了其間隔子含量、CRISPR序列及Cas蛋白的分布，通過PCR篩選后發(fā)現(xiàn)29株菌中含有完整的CRISPR系統(tǒng)，Ⅱ型豐富度最高，僅在副干酪乳桿菌85中發(fā)現(xiàn)Ⅰ型CRISPR系統(tǒng)且該系統(tǒng)較為活躍。ROGALSKI等[38]利用CRISPR間隔序列長(zhǎng)度成功在發(fā)酵面團(tuán)中分離出11種舊金山乳桿菌(Lacto-

表3 CRISPR介導(dǎo)的基因編輯Table 3 CRISPR mediated gene editing

bacillussanfranciscensis)菌株。SCALTRITI等[39]分析了25株瑞士乳桿菌CRISPR序列差異性，所有菌株均屬Ⅰ型系統(tǒng)且發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的crispr重復(fù)家族lhel3。應(yīng)用這種方法為預(yù)測(cè)CRISPR的潛在功能以及演化方向提供了一定的見解(表4)。

表4 利用CRISPR序列分析Table 4 Interspecific classification using CRISPR system

4 展望

CRISPR-Cas系統(tǒng)作為一種強(qiáng)大的基因編輯技術(shù)，已廣泛用于基因編輯、堿基編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、熒光成像等領(lǐng)域，為各個(gè)行業(yè)提供了一種新型生物技術(shù)工具，從最初的CRISPR免疫系統(tǒng)到基因編輯系統(tǒng)的開發(fā)及不斷完善，但在乳酸菌基因編輯方面還不夠成熟，雖然二型CRISPR系統(tǒng)在乳酸菌中得到廣泛應(yīng)用，但其存在一定的局限性，不同乳酸菌外源性Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化條件不同，需要進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化為接下來的操作打下基礎(chǔ)。Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后Cas9蛋白有時(shí)并不能與靶標(biāo)基因進(jìn)行精準(zhǔn)的結(jié)合，導(dǎo)致其產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。STOUT等[41]將干擾質(zhì)粒導(dǎo)入加氏乳桿菌篩選出靶向逃逸的Cas9，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)間隔子的缺失是Cas9靶向逃逸的原因之一。Cas9靶向雙鏈斷裂時(shí)乳酸菌自身缺陷所帶來的基因毒性等副作用和sgRNA的表達(dá)量不足影響后續(xù)的基因組編輯，同時(shí)因其在乳酸菌中不同物種之間對(duì)雙鍵斷裂的致死率差異較大，對(duì)基因組應(yīng)用的范圍得不到擴(kuò)展，LEENAY等[42]證實(shí)了植物乳桿菌菌株之間基因編輯的差異性，在3種不同的植物乳桿菌菌株(WCFS1，WJL和NIZO2877)中，對(duì)SpyCas9編輯的2種不同方法進(jìn)行了直接比較,發(fā)現(xiàn)在多個(gè)植物乳桿菌菌株中編輯同一位點(diǎn)并不總是成功。所以未來需要更多功能獨(dú)特的新型菌株來進(jìn)行CRISPR系統(tǒng)開發(fā)。

當(dāng)然，這些問題是可以解決的，目前已經(jīng)有了有效的應(yīng)對(duì)方案，利用電轉(zhuǎn)化的方式將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸菌中大大提高了轉(zhuǎn)化效率。針對(duì)Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，研究者可改變Cas9蛋白的特性，使其靶向目的基因更加精準(zhǔn)，或通過設(shè)計(jì)更加具備兼容性的PAM序列來提高Cas9靶向的效率，該策略已在人體細(xì)胞中得以成功應(yīng)用，擴(kuò)展了Cas系統(tǒng)的靶向范圍。通過Cas9切口酶大大降低了因雙鏈斷裂導(dǎo)致的致死性，通過利用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子優(yōu)化基因編輯工具，PCR獲得不同的啟動(dòng)子片段，利用無縫克隆的方法，替換原有的啟動(dòng)子提高了sgRNA的表達(dá)量。CRISPR-Cas9乳酸菌編輯技術(shù)已經(jīng)成為研究人員的熱點(diǎn)，從此系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)到可以自由對(duì)基因的改造實(shí)現(xiàn)了巨大的飛躍，在外源性CRISPR方面將會(huì)開發(fā)更加廣譜且簡(jiǎn)便的編輯工具，對(duì)內(nèi)源性CRISPR菌株的挖掘?yàn)橐院笮滦腿樗峋甑拈_辟提供了可能性。而且在不久的將來將會(huì)出現(xiàn)更多的亞型和Cas蛋白的突變體并應(yīng)用到乳酸菌中。