趙紅宇，景志剛，周盛華，關文鳳，王春柳

（1. 黑龍江康普生物科技有限公司，黑龍江哈爾濱 150025；2. 黑龍江省牛初乳工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150025）

0 引言

糙米中含有蛋白質、礦物質、谷維素、維生素、谷固醇、碳水化合物及豐富的膳食纖維[1]。相較于經(jīng)打磨去掉米糠層及胚后的普通精米，糙米保留了絕大部分膳食纖維、維生素[2]。同時，發(fā)芽糙米有較好的醫(yī)療保健效果，對Ⅱ型糖尿病、老年癡呆、高血脂及癌癥有較好的預防作用。其市場開發(fā)潛力巨大，比糙米擁有更多營養(yǎng)成分，都是市售精米無法比擬的，由于糙米中存在抗營養(yǎng)因子——植酸，抗營養(yǎng)因子可以和人體體細胞表層的糖蛋白和低聚糖進行結合，還可以與紅細胞發(fā)生凝結作用，抑制人體對糙米中營養(yǎng)成分的消化吸收，因此糙米并未體現(xiàn)出比普通精米更高的營養(yǎng)價值[3]。

目前發(fā)現(xiàn)，熱處理可以降低塊莖類食品中植酸的含量，但對谷類和豆類食品則沒有效果。Michal M等人[4]發(fā)現(xiàn)在食品加工過程中，植酸在長時間高溫下可能發(fā)生降解。Anuttam P[5]發(fā)現(xiàn)在147 ℃下烘烤15 min對于植酸含量可以起到顯著降低的作用（p=0.05），由此可見，熱處理具有降低植酸抗營養(yǎng)作用，但其最終降低效果還有待進一步研究及證實。植酸的化學降解也可以通過控制pH 值來實現(xiàn)，溶液pH 值在4.5～5.5 時，大豆中的植酸可以被降解，此時大豆蛋白的溶解度最低為35%～75%[6]。此外，隨著科技迅猛發(fā)展通過基因克隆生產(chǎn)出具有植酸酶的基因，利用重組表達技術將植酸酶基因轉移到植物中成為近年來的研究熱點[7]。

外源酶制劑的引入不僅可以補充和維持動物體內(nèi)的酶活性，還可以保障營養(yǎng)的利用率，并且能夠滅活食物中的部分抗營養(yǎng)因子[8]。對于弘揚中國傳統(tǒng)飲食文化、建立和諧的飲食結構、開發(fā)環(huán)境友好型食品資源具有重要意義。同時，也可以為糙米及其制品的科學消費提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

次氯酸鈉（NaClO），山東力昂新材料科技有限公司提供；蒸餾水（H2O）、植酸（C6H18O24P6），南京都萊生物技術有限公司提供；氯化鐵（FeCl3）、磺基水楊酸（C7H6O6S）、氯化氫（HCl）、硫酸鈉（Na2SO4）、氫氧化鈉（NaOH）、冰乙酸、纖維素酶（U）、果膠酶（U）。

JA1003 型電子分析天平，廣西順德電器有限公司產(chǎn)品；LC-LX-HL210D 型臺式高速離心機，山東億偉安化工科技有限公司產(chǎn)品；DHG-9203A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海偉安化學試劑器械廠產(chǎn)品；1 000 μL 微量可調移液器，上海雷磁有限公司產(chǎn)品；HH-2 型恒溫水浴鍋，上海力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；PHS-25 型pH 計，山東億偉安化工科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的測定

取8 支試管，分別加入質量濃度為0.1 g/L 的植酸標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，加蒸餾水至3 mL，再加0.03% FeCl3·6H2O 0.3%磺基水楊酸1 mL，搖勻待測。蒸餾水調零，于波長500 nm處測吸光度。以標準溶液中的植酸含量（μg/3mL）為橫坐標、吸光度為縱坐標，制作標準曲線。

根據(jù)公式：

式中：X——樣品中植酸的含量，g/100 g。

1.2.2 不同酶解溫度對發(fā)芽糙米的植酸含量影響

選取發(fā)芽糙米2 g 用粉碎機打成粉末狀進行試驗，酶解時間60 min，溶液pH 值為4，酶用量5 mL，分別控制酶解溫度為27，37，47，57，67 ℃，以發(fā)芽糙米植酸含量為考查指標。

1.2.3 不同酶解時間對發(fā)芽糙米的植酸含量影響

選取發(fā)芽糙米2 g 用粉碎機打成粉末狀進行試驗，酶解溫度47 ℃，溶液pH 值為4，酶用量5 mL，確定酶解時間為15，30，60，90，120 min，采用發(fā)芽糙米植酸含量為考查指標。

1.2.4 不同pH 值對發(fā)芽糙米的植酸含量影響

選取發(fā)芽糙米2 g 用粉碎機打成粉末狀進行試驗，酶解溫度47 ℃，酶解時間60 min，酶用量5 mL，分別控制溶液pH 值為2，3，4，5，6，以發(fā)芽糙米植酸含量為考查指標。

1.2.5 不同加酶量對發(fā)芽糙米中植酸含量的影響

選取發(fā)芽糙米2 g 用粉碎機打成粉末狀進行試驗，酶解溫度47 ℃，酶解時間60 min，溶液pH 值為4，纖維素酶與果膠酶按體積比1∶1 進行配置分別控制酶用量為1，2，5，10，15 mL，以發(fā)芽糙米植酸含量為考查指標。

1.2.6 響應曲面試驗設計

采用Box-behnken 試驗原理，單因素試驗情況為依據(jù)，選出對發(fā)芽糙米植酸含量顯著的3 個影響因素包括酶解溫度（A）、溶液pH 值（B）、酶用量（C） 進行17 個試驗點的響應曲面分析試驗。

響應面試驗設計見表1。

表1 響應面試驗設計

1.2.7 樣品中植酸的提取

取樣品0.75 g，加入1.2%HCl 10%Na2SO4溶液30 mL，室溫下攪拌2 h，以轉速4 500 r/min 離心30 min，得到上清液，于4 ℃冰箱中保存。

1.2.8 樣品中植酸的測定

取上清液5 mL、15%三氯乙酸（TCA） 5 mL 于離心管中，混勻，4 ℃冰箱中靜置2 h，然后以轉速4 500 r/min 離心30 min。取上清液5 mL，用0.75%NaOH 調節(jié)其pH 值至6.2 左右，加水至75 mL，混和均勻，取3 mL 稀釋液，加入0.03%FeCl3·6H2O 0.3%磺基水楊酸1 mL，混勻后于波長500 nm 處比色測定。其計算方法同1.2.1。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的測定

植酸標準曲線見圖1。

圖1 植酸標準曲線

2.2 不同酶解溫度對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

不同酶解溫度對發(fā)芽糙米植酸含量的影響見圖2。

由圖2 可知，隨著酶解溫度的升高，發(fā)芽糙米的植酸含量呈先降低后趨于平穩(wěn)波動性變化，在47 ℃左右發(fā)芽糙米中植酸含量存在最小值，其次溫度的繼續(xù)升高，植酸含量接近于平穩(wěn)有小幅增加。主要原因是由于反應進行，溫度逐漸上升，超過纖維素酶和果膠酶的最適溫度，對復合酶的抑制作用增強，即不能完全酶解發(fā)芽糙米中的植酸。綜合考慮，酶解溫度在47 ℃為宜。

圖2 不同酶解溫度對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

2.3 不同pH 值對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

不同pH 值對發(fā)芽糙米植酸含量的影響見圖3。

圖3 不同pH 值對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

酶解pH 值為2～3 時，植酸含量有所下降。隨著pH 值逐漸增加，酶解率也逐漸提升，植酸含量逐漸減少。所以最適pH 值應該在5 左右，此時其生長環(huán)境為偏酸性，出現(xiàn)植酸含量的最低值。pH 值過低或過高都不利于復合酶酶解反應的進行，阻礙酶促反應速率。因此，利用復合酶進行反應時應注重pH 值的調節(jié)。綜合考慮，pH 值在5 為宜。

2.4 不同酶用量對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

不同酶用量對發(fā)芽糙米植酸含量的影響見圖4。

圖4 不同酶用量對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

由圖4 可知，隨著酶用量增加，植酸含量逐漸降低。但當酶用量為5 mL 左右時，植酸含量逐漸呈現(xiàn)平緩趨勢，不再下降。為不浪費酶液的使用，有利于酶解反應的進行，當復合酶用量為5 mL時，植酸含量達到最低。隨著加酶量的增多，發(fā)芽糙米中植酸含量略有浮動，之后植酸含量基本為持平狀態(tài)。略有小幅度上升趨勢，不再呈現(xiàn)下降趨勢。綜合考慮，加酶量在5 mL 為宜。

2.5 不同酶解時間對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

不同酶解時間對發(fā)芽糙米植酸含量的影響見圖5。

圖5 不同酶解時間對發(fā)芽糙米植酸含量的影響

酶解時間也會進一步影響到發(fā)芽糙米中植酸的含量。酶解時間延長，發(fā)芽糙米中植酸含量逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，但當酶解時間在60 min 左右時，出現(xiàn)一個植酸含量的最低值。說明此酶解時間適合復合酶的酶解反應，可有效促進發(fā)芽糙米中植酸的分解。隨著時間的持續(xù)增長植酸含量不再出現(xiàn)變化。時間過長對植酸分解反應試驗并未起到促進作用，反之時間過短則使復合酶分解植酸的反應進行不完全，因此時間過長或過短都不利于酶解反應的進行。綜合考慮，酶解反應最適時間約為60 min。

2.6 響應曲面試驗結果

根據(jù)各因素對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的重要程度，選取對植酸含量影響較高的3 個重要因素酶解溫度、pH 值及酶用量進行響應面試驗，在酶解溫度為47 ℃，pH 值為5，酶用量為5 mL 條件的左右位置兩側，設置一個對比試驗點，進行響應面試驗操作，其中控制酶解時間為60 min 不變。采用Box-behnken 設計對外源酶降解發(fā)芽糙米中植酸的條件進行優(yōu)化。

響應曲面試驗設計方案及結果見表2。

2.6.1 響應面分析數(shù)學模型的建立

針對表2 中的試驗數(shù)據(jù)，在對其響應面進行回歸分析時，可以發(fā)揮Design Expert 8.0[9]軟件優(yōu)勢，得到試驗的回歸模型方程為：

回歸及方差分析見表3。

2.6.2 各因素影響程度分析

由表3 可知，二次回歸模型的方差分析該模型，失擬項p=0.103 5＞0.05，說明模型預測值與實際誤差值較小，模型的擬合程度良好，未知因素對試驗結果干擾很小。3 個因素的p 值均＜0.01，表明酶解溫度、pH 值及酶用量均是影響外源酶降解發(fā)芽糙米中植酸含量的重要因素[9]。判斷這些因素同試驗指標的關聯(lián)程度[10]，以其本身所有的F值為依據(jù)，數(shù)據(jù)結果越大，則表明對試驗指標的影響越大。從方差分析結果可知，F(xiàn)（A）=9.21，F(xiàn)（B）=0.56，F(xiàn)（C）=11.25，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，對響應值的影響排序為C＞A＞B，進一步證明該回歸方程在分析外源酶對發(fā)芽糙米中植酸含量的影響具有一定的優(yōu)勢[11]。根據(jù)表2可知，在回歸方程中，交互項顯著的存在于其所具有的一次項A，B，C自變量參數(shù)，及二次項A2，B2，C2自變量參數(shù)當中，從而說明外源酶降低發(fā)芽糙米中植酸含量會受到3種因素的顯著性影響，同時3種因素之間也呈現(xiàn)一定的交互特征。

表2 響應曲面試驗設計方案及結果

2.6.3響應面分析

響應面分析利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，二次模型所得到的等高線及響應曲面3D效果。

pH值和酶用量對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應曲面見圖6，酶用量和酶解溫度對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應曲面見圖7，酶解溫度和pH值對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應曲面見圖8。

圖6 pH值和酶用量對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應曲面

圖7 酶用量和酶解溫度對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應曲面

根據(jù)二次模型所得到的等高線及響應曲面可以評價試驗因素之間的交互作用強度，以及確定各因素的最佳水平范圍。在分析交互作用時，AC組的p值最小且小于0.01，說明AC對發(fā)芽糙米中植酸含量的降解發(fā)揮作用極顯著。

由圖6可知，當酶用量不變時，隨著pH值的升高，曲線走勢較為平緩；當pH值不變時，酶用量增加，發(fā)芽糙米中植酸含量先減少后增多，結合方差分析說明，酶用量和溫度交互作用較為顯著。由圖7可知，當酶用量穩(wěn)定時，酶解溫度增加發(fā)芽糙米中植酸含量呈先減少后增多趨勢；當酶解溫度穩(wěn)定不變時，隨酶用量增加，發(fā)芽糙米中植酸含量呈逐漸減少后增多的相同趨勢；結合方差分析結果，酶解溫度和酶用量間交互作用顯著。由圖8 可知，當pH值不變時，隨酶解溫度升高，發(fā)芽糙米中植酸含量呈先減少后增多趨勢；當酶解溫度不變時，pH 值增加，降解率緩緩增加，曲線很平緩，結合方差分析說明溫度和接種量交互作用不顯著。由各因素交互作用影響發(fā)芽糙米中植酸含量的等高線圖和曲面圖可知，當各因素的值處于中等水平時，曲面中心區(qū)域的發(fā)芽糙米中植酸含量較少，并存在極低點。

圖8 酶解溫度和pH 值對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的等高線和響應曲面

借助Design Expert 8.0 軟件，為驗證外源酶對發(fā)芽糙米中植酸含量影響的響應模型的準確性和可靠性，在最佳條件下，進行3 次平行試驗驗證?？紤]試驗的實際情況，經(jīng)過對所得回歸方程取一階偏導等于0，得知A=45.57，B=4.90，C=6.05 為最佳組合，在此最優(yōu)組合中，理論植酸含量為0.259±0.22 g/100 g。接近預測的理論值，表明該數(shù)學模型對外源酶降解發(fā)芽糙米植酸含量的優(yōu)化工藝可行。綜合考慮理論數(shù)值和實際應用性，外源酶降解發(fā)芽糙米植酸最佳條件為酶解溫度46 ℃，pH 值4.90，酶用量6.05 mL。

2.7 外源酶對發(fā)芽糙米植酸降解率結果

采用分光光度法測定酶解后發(fā)芽糙米中植酸含量。采用響應面優(yōu)化試驗最佳條件處理發(fā)芽糙米中植酸含量變化情況。

酶解后發(fā)芽糙米中植酸含量變化情況見表3。

由表3 計算出經(jīng)優(yōu)化植酸降解條件后，采用果膠酶和纖維素酶混合處理后糙米中植酸含量降解率為58.89%。

表3 酶解后發(fā)芽糙米中植酸含量變化情況/g·（100 g）-1

3 結論

采用分光光度法、單因素試驗、響應曲面法等方法，添加外源酶，并對外源酶降解植酸條件進行優(yōu)化分析，得到主要結論如下：單因素試驗結果外源酶降解發(fā)芽糙米中植酸的最佳條件為酶解溫度47 ℃，pH 值5，酶用量5 mL，酶解時間1 h。響應面試驗中確定3 個重要因素，經(jīng)Design Expert 8.0 軟件響應面分析優(yōu)化，模型擬合性良好，外源酶降解發(fā)芽糙米中植酸含量的最理想降解條件為酶解溫度46 ℃，pH 值4.90，酶用量6.05 mL。在此條件下進行試驗，酶解時間1 h，此時發(fā)芽糙米中植酸含量酶解率最高，為58.89%。