王 倩，喇林立，劉貴琴，白 雪，楊建鑫，段雅彬，朱俊博，周 楊，顧文琦，李向陽，3*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；3.三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海 西寧 810016)

如何提高黃香愈膚乳膏的透皮吸收率是實現(xiàn)藥物設(shè)計目的的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是目前膏劑類產(chǎn)品品質(zhì)控制的難點。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，在乳膏劑中加入丙二醇、氮酮及薄荷醇等促滲劑，考察累積滲透量和穩(wěn)態(tài)透皮速率及取樣末點鹽酸小檗堿的皮膚滯留量，以此綜合判斷丙二醇、氮酮、薄荷醇對黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿體外透皮吸收的影響。本研究通過對黃香愈膚乳膏體外滲透特性的研究，為最佳透皮劑篩選提供了依據(jù)，同時也為該制劑的安全性評價提供了參照，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

薄荷醇(批號：D813157，99%)、1，2-丙二醇(批號：P815581，分析純)、氮酮(批號：A800359，97%)、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(批號：C10835997)均購自上海麥克林生化科技有限公司，乙醇(批號：20201128，分析純)購自天津市博華通化工產(chǎn)品銷售中心，生理鹽水(批號：H37020764，0.9%)購自山東齊都藥業(yè)有限公司。

1.1.2 儀器

BT25S電子天平購自德國賽多利斯科學(xué)儀器公司，TGL-16B離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠，XHF-DY高速分散器購自寧波新芝生物科技股份有限公司，HK-300CDE型超聲波清洗器購自杭州市匯爾儀器設(shè)備有限公司，LC-2030 Plus高效液相色譜儀購自島津馬來西亞工廠，YB-P6智能透皮實驗儀購自天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器制造廠。

1.1.3 實驗動物

SPF級健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200±20 g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，合格證編號：SCXK(陜)2018-001。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸小檗堿含量測定

1.2.1.1 色譜條件選擇

XDB-C18色譜柱(3.0×250.0mm，5μm)，流動相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(0.1%磷酸，35：65)，體積流量0.5 mL/min，檢測波長345 nm，柱溫30 ℃，進樣量為40 μL。

1.2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品5.02 mg置于5 mL容量瓶中，加流動相定容至刻度，即得濃度為1000 μg/mL鹽酸小檗堿對照品溶液，按比例稀釋成濃度為10.000、5.000、1.000、0.500、0.100、0.010、0.002 μg/mL的鹽酸小檗堿對照品工作液。

1.2.1.3 供試品溶液制備

取透皮實驗中獲得的接收液離心(12000r/min，5min)取上清液，用微孔濾膜(0.22μm)濾過，即得供試品溶液。

1.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取“1.2.1.2”項下制備的鹽酸小檗堿對照品工作液，進樣分析，記錄峰面積，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=341005x-2997.2，R2=1，結(jié)果顯示在0.002～10.000 μg/mL范圍內(nèi)，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好。

1.2.1.5 專屬性考察

精密量取空白皮膚接收液、供試品溶液、對照品溶液做進樣分析，實驗結(jié)果顯示皮膚接收液中的內(nèi)源性物質(zhì)對供試品溶液中鹽酸小檗堿的含量測定無干擾作用，表明此方法專屬性良好。接收液的HPLC圖見圖1。

1.2.1.6 精密度實驗

精密量取10.00、1.00、0.01 μg/mL鹽酸小檗堿對照品溶液，于1 d內(nèi)重復(fù)進樣6次，3 d內(nèi)每天重復(fù)進樣2次(每12h 1次)，測定各成分的峰面積，結(jié)果顯示高、中、低濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液日內(nèi)精密度RSD分別為1.15%、0.08%、0.01%，日間精密度RSD分別為1.62%、0.94%、1.85%，表明儀器的精密度良好。

1.2.1.7 重復(fù)性實驗

按“1.2.1.3”項下供試品溶液的制備方法，取同一時間點的6份樣品測定峰面積，考察方法的重復(fù)性，結(jié)果顯示試品溶液峰面積的RSD為2.75%，表明方法的重復(fù)性良好。

1.2.1.8 穩(wěn)定性實驗

精密量取“1.2.1.3”項下制備的供試品溶液適量，于制備后0、2、4、6、8、12、24 h做進樣分析，結(jié)果顯示供試品溶液濃度的RSD為2.16%，表明供試品溶液在0～24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.1.9 加樣回收率實驗

在已知量的低、中、高3個濃度的樣品透過液中加入等體積濃度為1、5、10 μg/mL的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個濃度制備3份樣品做進樣分析，實驗結(jié)果顯示，1、5、10 μg/mL的鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為100.81%、96.10%和95.29%，RSD分別為0.83%、0.51%和0.15%，符合規(guī)定。加樣回收率實驗結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

1.2.1.10 供試品溶液測定

取“1.2.1.3”項下的供試品溶液，按上述色譜條件做進樣分析，測定各樣品峰面積并計算濃度。

1.2.2 體外透皮實驗

1.2.2.1 離體鼠皮的制備

用異弗烷麻醉大鼠后，以生理鹽水濕潤大鼠背部毛發(fā)，用手術(shù)刀片將其剔除干凈，12 h后脫頸處死，剝離背部皮膚，剔除皮下脂肪組織和血管，用生理鹽水沖洗干凈后平鋪于鋁箔上置-20 ℃冰箱凍存。實驗前將皮膚自然解凍，檢視皮膚是否完整。

1.2.2.2 促滲劑的初步選擇

選擇濃度為1%、2%、3%、5%的丙二醇、氮酮及薄荷醇作為單一促滲劑，選擇各濃度促滲劑兩兩聯(lián)用作為復(fù)合促滲劑，分別加入乳膏中，選擇對乳膏性狀及穩(wěn)定性無影響的促滲劑做進一步研究。

1.2.2.3 體外透皮實驗

將制備好的離體皮膚自然固定在Franz擴散池(有效透皮面積為2.01cm2，接收液體積為17mL)上，角質(zhì)層面朝供給室。精密稱取乳膏劑1.0 g均勻涂布于大鼠角質(zhì)層上，用一層塑料薄膜覆蓋。以20%乙醇-生理鹽水溶液為接收液，將接收液超聲30 min后加入接收池(水浴溫度為37℃±2℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min)平衡1 h，排除氣泡。于給藥前及給藥0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h時從接收室取樣1.0 mL，每次取樣后立即補足等體積的新鮮接收液，用HPLC儀檢測接收液中鹽酸小檗堿濃度，按如下公式計算體外經(jīng)皮滲透參數(shù)：

其中，Qn表示各成分在單位面積上的累積透過量(μg·cm-2)；Cn表示第n個取樣點測得的接收液中藥物的濃度(μg·mL-1)；Ci表示第i(i=n-1)個取樣點測得的接收液中的藥物濃度(μg·mL-1)。

以Qn對取樣時間t作圖，繪制含有不同促滲劑的黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的累計滲透曲線。以Qn對t作線性回歸，所得方程即滲透動力學(xué)方程，直線的斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率Js(μg·cm-2·h-1)。使用OriginPro 8.0軟件對鹽酸小檗堿累計透皮量進行零級動力學(xué)模型、一級動力學(xué)模型與Higuchi模型擬合。

于結(jié)束時取下鼠皮，分離皮膚層和乳膏層，剪去多余的皮膚，剩下與乳膏接觸的皮膚備用。將取下的皮膚剪碎、研磨至乳糜狀，加入2 mL甲醇，超聲振蕩，用微孔濾膜(0.22μm)濾過，注入HPLC儀測定峰面積，計算皮膚滯留量。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 促滲劑的初步篩選

促滲劑初步篩選結(jié)果表明以2%丙二醇、2%薄荷醇、2%氮酮、2%丙二醇+2%薄荷醇、2%丙二醇+2%氮酮作為促滲劑時，乳膏的外觀性狀及離心穩(wěn)定性均無明顯變化，因此選擇上述促滲劑進行進一步體外透皮實驗研究。

2.2 體外透皮實驗

體外透皮實驗結(jié)果顯示，不同促滲劑對黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的體外透皮吸收性能產(chǎn)生不同影響，且差異較大，與不含促滲劑組相比，2%丙二醇組第12 h的鹽酸小檗堿累計滲透量顯著升高了92.92%(P<0.05)，2%薄荷醇組、2%丙二醇+2%薄荷醇組有一定的升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義，2%氮酮組顯著降低了78.86%(P<0.05)，2%氮酮+2%丙二醇組有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。不同促滲劑的黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的累計滲透曲線見圖2，第12 h鹽酸小檗堿的累計滲透量見表2。

圖2 含不同促滲劑黃香愈膚乳膏累計滲透曲線

表2 含不同促滲劑黃香愈膚乳膏經(jīng)皮滲透參數(shù)

與不含促滲劑組相比，2%丙二醇組的鹽酸小檗堿的穩(wěn)態(tài)透皮速率顯著升高了86.67%(P<0.05)；2%薄荷醇組和2%薄荷醇+2%丙二醇組有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；2%氮酮和2%氮酮+2%丙二醇組有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。綜合考慮，2%丙二醇為最佳促滲劑。穩(wěn)態(tài)透皮速率結(jié)果見表2。

與不含促滲劑組相比，除2%丙二醇組的鹽酸小檗堿的皮膚滯留量變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)外，其余各組均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。鹽酸小檗堿皮膚滯留量見表2。

分別采用零級動力學(xué)模型、一級動力學(xué)模型與Higuchi模型對黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的體外透皮吸收曲線進行回歸分析，結(jié)果顯示，相比于零級動力學(xué)模型和Higuchi模型，各組一級動力學(xué)模型的R2均較高，說明無論使用何種透皮劑，黃香愈膚乳膏中鹽酸小檗堿的濃度變化規(guī)律都更符合一級動力學(xué)模型。擬合方程結(jié)果見表3。

表3 含不同促滲劑黃香愈膚乳膏透皮吸收動力學(xué)方程

3 討論

體外透皮實驗是測定外用制劑經(jīng)皮擴散特性最常用的方法。大鼠皮膚的組織結(jié)構(gòu)與人體皮膚基本一致[1，2]，因此本實驗選擇大鼠背部皮膚考察黃香愈膚乳膏的經(jīng)皮滲透特性。

體外透皮實驗中接收液模擬了皮膚下的體液，體外實驗要求接收液不能與藥物發(fā)生反應(yīng)，同時符合漏槽條件[3]，一般以生理鹽水、磷酸鹽緩沖液(PBS)等作為接收液，為增大脂溶性藥物的溶解度，通常會加入一定比例的有機溶劑，本實驗在前期研究中分別在生理鹽水及PBS中加入了10%、20%、30%的無水乙醇，測定中藥提取浸膏在上述接收液中飽和時鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生理鹽水中測得的鹽酸小檗堿含量高于PBS中測得的鹽酸小檗堿含量，且乙醇含量越多，鹽酸小檗堿含量越高。有研究指出，當(dāng)乙醇含量超過20%時，皮膚褶皺展開，毛囊口擴張，皮膚正常生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[4]。因此本實驗最終以20%的乙醇-生理鹽水作為接收液。

在研究中藥復(fù)方外用制劑時，為提高其有效成分的透皮量，通常會在其中加入一定比例的透皮劑，目前常用的透皮劑種類包括亞砜類(如DMSO)、脂肪酸酯類(如IPM、PGML)、氨基化合物類(如氮酮)、有機醇類(如丙二醇)等，這類透皮劑通過改變角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)或者增加促滲劑與角質(zhì)層的作用來增強藥物在皮膚中的滲透能力[5，6]。其中，氮酮、丙二醇、薄荷醇為最常用的促滲劑，其不僅有較好的促透作用，且毒性小、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[7-9]，因此本實驗選擇上述三種單一促滲劑及兩兩聯(lián)用的復(fù)合促滲劑開展體外透皮性能研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以丙二醇作為促滲劑時，透皮效果較好，相較于不含促滲劑組，其累計滲透量及穩(wěn)態(tài)透皮速率均顯著升高，故最終選擇2%的丙二醇作為黃香愈膚乳膏的促滲劑。研究發(fā)現(xiàn)丙二醇組的皮膚滯留量與不含促滲劑組相比無明顯變化，而其他各組均顯著降低，其原因可能與各促滲劑的不同促滲機制相關(guān)，丙二醇通過作用于細胞內(nèi)途徑提高藥物的透過量，而薄荷醇和氮酮屬于油性介質(zhì)，主要是通過增加藥物在脂質(zhì)分子層中的溶解增加藥物的滲入量[10-12]，由此造成不同組皮膚滯留量及累計滲透量之間的差異。

本研究對促滲劑的考察發(fā)現(xiàn)氮酮作為促滲劑時，無論單獨使用還是與丙二醇聯(lián)合使用，促滲效果均不理想，有研究指出，氮酮對log Ko/w值約為-0.5的藥物具有較好的促透作用[13]，而鹽酸小檗堿log Ko/w=3.45，由此導(dǎo)致氮酮對鹽酸小檗堿的促透效果不佳。此外，許多研究都發(fā)現(xiàn)氮酮對藥物的促透作用并非與氮酮添加量成正比[14，15]，本研究中以不影響乳膏性狀的最大濃度氮酮作為透皮劑，故本研究中鹽酸小檗堿的透過量低也可能是因為所選擇的氮酮濃度不合適，未達到最佳促滲效果。也有研究發(fā)現(xiàn)以氮酮作為軟膏劑的促滲劑時透皮效果差，指出是由于氮酮的加入導(dǎo)致軟膏劑粒徑增大，從而阻礙了藥物的透皮吸收[16]，但本實驗中是否存在該問題還需要進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿可降低人皮膚成纖維細胞中紫外線誘導(dǎo)的MMP-1表達，增加Ⅰ型膠原蛋白的表達，還可以預(yù)防皮膚炎癥和細胞外基質(zhì)蛋白的降解[17，18]。由此認為，鹽酸小檗堿是黃香愈膚乳膏中抗紫外線損傷的主要成分。此外，本研究在做線性關(guān)系考察時發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿具有很強的紫外線吸收能力，以HPLC儀檢測時，其檢測限可至0.002 μg/mL，透皮實驗0～4 h為透皮吸收的平緩期，此時接收液中鹽酸小檗堿的濃度較低，而基于鹽酸小檗堿化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、檢測靈敏度高的特點，采用HPLC法即可檢測接收液中的鹽酸小檗堿，故本實驗采用鹽酸小檗堿值作為透皮吸收的檢測指標(biāo)是可行的。