張 雨，郝彥惠，王 財(cái)，張 偉，陳 凡*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001)

射線照射在提高胸部腫瘤治療療效的同時(shí)，不可避免地引起放射性心臟損傷(Radiation-induced heart damage，RIHD)，限制了臨床腫瘤靶區(qū)的受照劑量。介導(dǎo)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白-3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein-3，NLRP-3)炎癥小體在改善心臟損傷中具有關(guān)鍵作用，但對(duì)放射性心臟損傷是否同樣具有改善作用目前未見(jiàn)報(bào)道，尤其是用黃芪甲苷(Astragaloside IV，AS-IV)介導(dǎo)NLRP-3炎癥小體改善小鼠放射性心臟損傷的研究尚屬空白[1-2]。本課題就此開(kāi)展相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6J小鼠40只，7周齡，無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)別，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2020-0004]。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心[許可證號(hào)：SYXK(青)2020-0001]，采用普通光照，予正常飲水及足夠的飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，于照射后第28天處死進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[3]。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

黃芪甲苷(純度>98%，貨號(hào)：SA8640)、蘇木素(貨號(hào)：G1080)、伊紅(貨號(hào)：G1100)購(gòu)自北京索萊寶有限公司。小鼠白介素-1β酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(IL-1β，貨號(hào)：E-EL-M0037c)和小鼠白介素-18酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(IL-18，貨號(hào)：E-EL-M0730c)購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。NLRP3抗體(貨號(hào)：A18281)、ASC抗體(貨號(hào)：A2156)、Caspase-1抗體(貨號(hào)：A0964)購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物公司。動(dòng)物氣體麻醉機(jī)購(gòu)自英國(guó)ELGA公司。醫(yī)用電子直線加速器(23EX)購(gòu)自美國(guó)VaRian公司。離心機(jī)(5811)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。iMark酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioRad公司。顯微鏡購(gòu)自寧波舜宇儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單純照射組和AS-IV低劑量組(AS-IV-L)、AS-IV高劑量組(AS-IV-H)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照射

小鼠用動(dòng)物氣體麻醉機(jī)進(jìn)行麻醉后于治療床上固定四肢，激光燈定位于心尖搏動(dòng)部，源皮距100 cm，射野約為1.0 cm×1.0 cm。除空白對(duì)照組外，其余組均采用6MV 20Gy射線單次局部照射心臟。照射完成后將小鼠送置動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥

AS-IV低劑量組(AS-IV-L)、AS-IV高劑量組(AS-IV-H)分別給予40、80 mg/kg AS-IV(灌胃)，空白對(duì)照組、單純照射組分別給予5 ml/kg生理鹽水(灌胃)。每日1次，連續(xù)28 d。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟組織形態(tài)觀察

將小鼠心臟組織固定、包埋、切片、脫蠟脫水、染色，鏡下觀察各組小鼠心臟組織形態(tài)的變化情況。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟組織中炎癥因子白介素-1β(IL-1β)、18(IL-18)的水平檢測(cè)

將小鼠心臟組織磨碎、離心、稀釋，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū)所示方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，在波長(zhǎng)450 μm處測(cè)量吸光度值，計(jì)算濃度。

1.3.6 NOD樣受體蛋白3(NLRP3)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(Caspase-1)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟組織中的表達(dá)水平檢測(cè)

使用蛋白印跡法(Western blotting，WB)。將心臟組織勻漿、離心、稀釋、定量、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別孵育一抗過(guò)夜，次日洗滌后孵育二抗，曝光，顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心臟組織的形態(tài)學(xué)變化

空白對(duì)照組心肌細(xì)胞排列規(guī)則，血管結(jié)構(gòu)完整清晰，血管內(nèi)皮完整。AS-IV-H組心肌細(xì)胞排列規(guī)則，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)欠清晰，較空白對(duì)照組病變略嚴(yán)重。AS-IV-L組心肌細(xì)胞排列規(guī)則，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)較模糊，局部區(qū)域血管內(nèi)皮細(xì)胞減少，少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞溶解，較空白對(duì)照組和AS-IV-H組病變略有加重。單純照射組血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)模糊，血管內(nèi)皮不完整，內(nèi)皮細(xì)胞明顯缺失，周?chē)倭啃募〖?xì)胞溶解，心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變形及斷裂，病變程度較AS-IV-L組有加重。見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色圖(400×)

2.2 各組小鼠心臟組織中炎癥因子IL-18、IL-1β表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，AS-IV-H、AS-IV-L和單純照射組IL-18、IL-1β的表達(dá)水平升高(P<0.05)；與AS-IV-H組比較，AS-IV-L和單純照射組IL-18、IL-1β的表達(dá)水平升高(P<0.05)；與AS-IV-L組比較，單純照射組IL-18、IL-1β的表達(dá)水平升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 IL-18、IL-1β表達(dá)水平

2.3 各組小鼠心臟組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，AS-IV-H、AS-IV-L和單純照射組NLRP3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與AS-IV-H組比較，AS-IV-L和單純照射組NLRP3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與AS-IV-L組比較，單純照射組NLRP3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2、表2。

A：空白對(duì)照組；B：AS-IV-H組；C：AS-IV-L組；D：?jiǎn)渭冋丈浣M

表2 NLRP3、ASC、Caspase-1在各組小鼠心臟組織中的表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，AS-IV-L組ASC蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與AS-IV-H組比較，AS-IV-L和單純照射組ASC蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2、表2。

與空白對(duì)照組比較，AS-IV-H、AS-IV-L和單純照射組Caspase-1蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。與AS-IV-H組比較，AS-IV-L和單純照射組Caspase-1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2、表2。

2.4 各組小鼠心臟組織中NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)情況

小鼠心臟組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)在IHC圖中表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)呈淡紫色著色。見(jiàn)圖3～5。

圖3 各組小鼠心臟組織中NLRP3的表達(dá)圖(400×)

圖4 各組小鼠心臟組織中ASC的表達(dá)圖(400×)

圖5 各組小鼠心臟組織中Caspase-1的表達(dá)圖(400×)

與空白對(duì)照組比較，AS-IV-H、AS-IV-L和單純照射組NLRP3蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。與AS-IV-H組比較，AS-IV-L和單純照射組NLRP3蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。與AS-IV-L比較，單純照射組NLRP3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)情況

與空白對(duì)照組比較，AS-IV-H、AS-IV-L和單純照射組ASC蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。與AS-IV-H組比較，AS-IV-L和單純照射組ASC表達(dá)水平上升(P<0.05)。與AS-IV-L組比較，單純照射組ASC蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

與空白對(duì)照組比較，AS-IV-H、AS-IV-L和單純照射組Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)。與AS-IV-H組比較，AS-IV-L和單純照射組Caspase-1蛋白表達(dá)水平上升(P<0.05)。與AS-IV-L組比較，單純照射組Caspase-1蛋白表達(dá)水平增高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

3 討論

NLRP-3炎癥小體是炎癥反應(yīng)的主要參與者，被射線激活后分解為NLRP3、ASC、Caspase-1并使炎癥因子IL-1β、IL-18釋放，加劇炎癥反應(yīng)[4]。研究顯示，AS-IV不僅能對(duì)抗心肌細(xì)胞損傷、緩解血管內(nèi)皮細(xì)胞障礙、促進(jìn)心血管生成，而且可降低NLRP-3在受損心臟組織中的表達(dá)[5-6]。Zhang T[6-7]等的實(shí)驗(yàn)表明，AS-IV可通過(guò)抑制NLRP-3炎癥小體的表達(dá)來(lái)緩解機(jī)械應(yīng)激引起的心臟損傷及輻射誘導(dǎo)的腎損傷。本研究建立在小鼠模型基礎(chǔ)上，探討AS-IV與小鼠RIHD中NLRP3的表達(dá)關(guān)系，為RIHD的臨床防治提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

NLRP-3是一種能夠感知損傷并釋放炎癥因子的炎癥小體，被激活后，接頭蛋白ASC可將其中的NLRP3與Caspase-1蛋白前體連接起來(lái)，促使Caspase-1活化繼而放大細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[8]。Zhang WJ[8]等認(rèn)為激活后的NLRP3可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞炎癥反應(yīng)且與缺血、損傷等心血管疾病密切相關(guān)。Smith AO[9-11]等認(rèn)為被電離輻射等因素激活后的Caspase-1在短期內(nèi)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后可誘導(dǎo)IL-1β、IL-18釋放，最終引起細(xì)胞炎性死亡。本研究中，小鼠心臟組織切片鏡下可見(jiàn)經(jīng)射線照射后，單純照射組小鼠心臟血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)模糊，內(nèi)皮細(xì)胞壞死、溶解或缺失等，其病理改變較空白對(duì)照組和AS-IV-H、AS-IV-L組明顯，AS-IV-L組中心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的病變程度較空白對(duì)照組和AS-IV-H組病變略有加重，提示AS-IV可緩解小鼠RIHD程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白在空白對(duì)照組和AS-IV-H組的表達(dá)活性明顯低于單純照射組及AS-IV-L組，表明在小鼠心臟模型中，AS-IV可減輕小鼠RIHD組織中NLRP-3炎癥小體的表達(dá)。IHC結(jié)果顯示，單純照射組和AS-IV-L組較空白對(duì)照組及AS-IV-H組染色增重，單純照射組染色重于AS-IV-L組，AS-IV-L組的淡紫色染色略重于AS-IV-H組，提示AS-IV可減少NLRP-3炎癥小體的表達(dá)。

炎癥因子IL-1β作為IL-1的主要分泌形式，在使免疫因子大量募集的同時(shí)，能夠明顯上調(diào)炎癥反應(yīng)水平[11-12]。Zeng ZL等[13]認(rèn)為心血管病的發(fā)生與IL-1β的大量釋放密切相關(guān)。炎癥因子IL-18在促進(jìn)細(xì)胞合成與分化的同時(shí)，能夠明顯上調(diào)炎癥反應(yīng)水平[11，14]。Sun W[15]的研究顯示，IL-18作為一種高效促炎因子，其高表達(dá)可引起冠心病等心血管疾病。Liao H[16]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)射線輻射后的細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-18的分泌水平增加，細(xì)胞活性降低。Mezzaroma E[17]等通過(guò)小鼠心臟實(shí)驗(yàn)表明，抑制NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表達(dá)可明顯減輕心臟損傷。本實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果顯示，單純照射組和AS-IV-L組中IL-1β、IL-18的表達(dá)量明顯增加，AS-IV-L組的表達(dá)較空白對(duì)照組和AS-IV-H組略高，AS-IV-L組的表達(dá)低于單純照射組的表達(dá)，提示IL-1β、IL-18參與了射線照射后心臟的損傷過(guò)程，并且AS-IV可減輕射線引起的這種心臟損傷。另外，本實(shí)驗(yàn)全程在青海西寧(海拔約2200m)進(jìn)行，高海拔缺氧環(huán)境下細(xì)胞間炎性浸潤(rùn)程度加重[18]，其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

綜上所述，AS-IV通過(guò)調(diào)控NLRP-3炎癥小體的表達(dá)改善小鼠RIHD程度，AS-IV對(duì)射線誘導(dǎo)的小鼠心臟損傷有一定修復(fù)保護(hù)作用。