高 翔，張 昱，朱沁芳，杜忠蕾，韓 瑩，賈茹涵，馬倩倩，周義玲，申香群，張 偉△

[1.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心；2.高原醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室；3.青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點實驗室(青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點實驗室)；4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧]

研究低氧對腸道免疫相關(guān)機(jī)制的影響，找到干預(yù)靶點，能夠解決高原地區(qū)腸源感染性疾病防控中的瓶頸性問題。本研究以小鼠感染腸道鼠枸櫞酸桿菌(Citrobacterrodentium)為模型，首次在高原環(huán)境下探討低氧對細(xì)菌感染小鼠腸道固有免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6野生型小鼠(18～20g)，8周齡，雌性，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(湘)2020-0001]，飼養(yǎng)于獨立通氣鼠籠(IVC，H6，蘇州實驗動物設(shè)備有限公司)。實驗方案通過青海大學(xué)動物保護(hù)倫理委員會審查。

1.1.2 實驗試劑

所用抗體購自美國BD和BioLegend公司；辣根過氧化物酶、TMB顯色液購自上海玉博生物科技有限公司；4%多聚甲醛和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自Solarbio公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與造模

將32只小鼠隨機(jī)分為常氧對照組(NC)、常氧感染組(NB)、低氧對照組(HC)和低氧感染組(HB)，每組8只。感染組小鼠通過灌胃(C.rodentium，菌量約為5×108CFU/mouse)造模。常氧組小鼠飼養(yǎng)于IVC鼠籠(2260m，大氣壓582mmHg，PO2121.6mmHg)，低氧組飼養(yǎng)于低壓氧倉(模擬海拔5000m，大氣壓405mmHg，PO284.7mmHg)。造模期間監(jiān)測小鼠體重和感染組小鼠排菌量以觀察其在低氧條件下的體重變化以及感染組小鼠排菌量的變化。1周后取材，收集結(jié)腸和脾臟，采集血清，用H&E染色法觀察炎癥病理變化，用PCR、Western blotting法檢測脾臟及結(jié)腸中吞噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子和趨化因子，用Elisa法檢測血清及脾臟組織中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平，用Immunofluorescence法觀察小鼠結(jié)腸及脾臟吞噬細(xì)胞趨化因子的表達(dá)水平。

1.2.2C.rodentium活化

配制C.rodentium菌懸液，在LB固體培養(yǎng)基及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離培養(yǎng)，倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)過夜。挑選單個C.rodentium菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)振蕩器內(nèi)(37℃，200r/min)過夜。將菌株復(fù)蘇活化后，通過傳代培養(yǎng)(2代)恢復(fù)活力，用于后續(xù)實驗。

制作小鼠結(jié)腸炎模型：用無菌PBS將C.rodentium菌液濃度調(diào)整為2.5×108CFU/mL，感染組小鼠灌胃菌量為5×108CFU/mouse。C.rodentium感染小鼠引發(fā)的腸黏膜炎癥與人類炎癥性腸病(IBD)癥狀相似，長期用于EPEC和EHEC感染的發(fā)病機(jī)制研究[1]，可作為研究小鼠腸源性感染性疾病和IBD的良好模型[2]。

1.2.3 小鼠體重、排菌量統(tǒng)計

自C.rodentium造模開始，每天稱重小鼠，監(jiān)測體重變化。同時收集感染組小鼠糞便，稱重，稀釋，調(diào)整濃度(0.1mg/μL)，混勻，做濃度梯度稀釋，取100 μL稀釋液接種在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，置37 ℃培養(yǎng)箱過夜，根據(jù)菌落數(shù)計算排菌量(CFU/g)。

1.2.4 實驗動物取材

摘除小鼠眼球取血，靜置2 h后離心收集血清備用；消毒小鼠腹部，開腹，取結(jié)腸測量長度；收集結(jié)腸和脾臟。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠表現(xiàn)

NB組小鼠出現(xiàn)感染細(xì)菌3天后狀態(tài)萎靡、便稀軟、背部隆起、毛發(fā)枯燥；HB組癥狀早于NB組出現(xiàn)，且更為明顯，并伴有輕微的便血。

2.2 小鼠體重變化及排菌量變化

小鼠體重變化：小鼠體重與初始體重相比。重復(fù)測量方差分析結(jié)果(表1)顯示，小鼠體重變化在不同時間段的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=16.119，P<0.001)，不同組間小鼠體重變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.149，P<0.001)，其中NB、HB組小鼠體重降低明顯，顯示感染能使小鼠體重減輕；HB組小鼠體重降低較NB組更為明顯，顯示低氧環(huán)境可降低感染后小鼠的體重。(圖1)

表1 小鼠體重與初始體重變化百分比

圖1 低氧處理1周小鼠體重變化圖

圖2顯示，感染組小鼠糞便細(xì)菌在麥康凱培養(yǎng)基上生長良好。計數(shù)菌落用以反映小鼠排菌程度。

圖2 細(xì)菌生長狀態(tài)圖

圖3和表2為各感染組間小鼠排菌量非參數(shù)檢驗結(jié)果，HB組小鼠排菌量較NB組明顯增加。排菌量的增加表示低氧暴露可使小鼠腸道清除細(xì)菌能力減弱，且NB組小鼠在第6、7天排菌量明顯下降(P<0.05)，說明常氧條件下機(jī)體清除細(xì)菌能力正常。

圖3 小鼠排菌量變化圖(＊：與NB組比較，P<0.05)

表2 感染組小鼠排菌量統(tǒng)計表[M(P25，P75)]

2.3 小鼠結(jié)腸長度變化及病理評分

感染組小鼠結(jié)腸縮短、變細(xì)，出現(xiàn)潰瘍現(xiàn)象。表3顯示，感染組小鼠結(jié)腸長度均變短，與對照組比較存在顯著性差異，說明小鼠在感染C.rodentium后，結(jié)腸炎癥反應(yīng)加劇，導(dǎo)致結(jié)腸縮短。NB組和HB組比較，二者存在明顯差異，說明低氧可以導(dǎo)致小鼠結(jié)腸縮短。組織病理學(xué)評分采用一種改良的評分方法[3]：細(xì)胞浸潤得分(評分范圍：0～4)和結(jié)腸組織損傷得分(評分范圍：0～4)之和。結(jié)果顯示(表3)，感染組與對照組比較，病理組織評分均存在顯著性差異。NB組和HB組比較，低氧情況下感染組病理評判結(jié)果差異更為顯著，說明低氧能加劇小鼠感染C.rodentium后結(jié)腸的病理損傷。

表3 小鼠結(jié)腸長度及病理評分

病理結(jié)果顯示(圖4)，對照組小鼠腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，絨毛排列整齊且隱窩較深；感染組小鼠腸黏膜組織發(fā)生損傷，腸壁變薄，發(fā)生水腫，絨毛長短不一且紊亂，隱窩變淺并伴有炎性細(xì)胞浸潤，HB組尤為明顯，結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整性破壞明顯，黏膜損傷嚴(yán)重。

圖4 結(jié)腸組織病理切片圖(20×，H&E)

2.4 小鼠脾臟炎性細(xì)胞浸潤變化

圖5顯示，感染組小鼠脾臟有大量炎性細(xì)胞浸潤。相比而言，HB組炎性細(xì)胞浸潤不如NB組嚴(yán)重。

圖5 脾臟組織切片(20×，H&E)

2.5 小鼠血清和脾臟、結(jié)腸中相關(guān)炎性因子表達(dá)

表4～5顯示，用C.rodentium感染小鼠后，NB、HB組血清和脾臟、結(jié)腸中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)水平均明顯增高，且血清中IL-6 表達(dá)增加。HB組各炎性因子表達(dá)水平雖均有增高，但不及NB組，提示低氧暴露可致炎性反應(yīng)能力下調(diào)。HC組與NC組比較，血清中IL-1β和脾臟中IL-1β、TNF-α炎性因子均有降低，提示低氧暴露可造成炎性反應(yīng)能力減弱。

表4 ELisa法檢測的血清及脾臟中相關(guān)炎性因子水平

表5 用PCR法檢測的結(jié)腸及脾臟中相關(guān)炎性因子

2.6 低氧暴露下的小鼠感染C.rodentium后對吞噬細(xì)胞的影響

表6～7及圖6～7為用PCR、Western blotting法和Immunofluorescence法檢測的小鼠脾臟和結(jié)腸中吞噬細(xì)胞的巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP2)、角質(zhì)細(xì)胞趨化因子(KC)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP1)水平。結(jié)果顯示，用C.rodentium感染小鼠后，脾臟、結(jié)腸中的中性粒細(xì)胞趨化因子MIP2、KC和巨噬細(xì)胞趨化因子MCP1表達(dá)水平與對照組比較均明顯增高。HB組與NB組比，MIP2、KC、MCP1均有所降低，提示低氧暴露可使機(jī)體中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞趨化能力有所下調(diào)。NC組與HC組比，低氧暴露同樣可以造成中性粒細(xì)胞趨化因子MIP2、KC和巨噬細(xì)胞趨化因子MCP1表達(dá)水平降低。

表6 用PCR法檢測的脾臟中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞趨化因子結(jié)果

表7 用免疫印跡法檢測的脾臟中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞趨化因子結(jié)果

圖6 各組小鼠脾臟及結(jié)腸組織細(xì)胞趨化因子圖

圖7 脾臟及結(jié)腸組織細(xì)胞趨化因子免疫熒光染色檢測圖(merge重合信號圖)

3 討論

氧是一種環(huán)境刺激及發(fā)育信號，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量產(chǎn)生、生長和分化過程，并調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)表型性狀。經(jīng)過長期進(jìn)化，生物體已形成一套完整的氧感受機(jī)制及在不同氧環(huán)境下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對保障組織細(xì)胞的正常功能具有重要的作用[4]。低氧的一個重要的細(xì)胞代謝特征是低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)升高，其通過調(diào)控多種相關(guān)基因參與人體的生理和病理過程[5]。

3.1 低氧暴露對小鼠結(jié)腸炎的影響

IBD是一種特異性易復(fù)發(fā)的腸道炎癥疾病，以結(jié)腸和直腸黏膜及黏膜下層的大量炎性細(xì)胞浸潤為主要特征。臨床的典型癥狀包括腹痛、腹瀉和便血。目前，化學(xué)誘導(dǎo)、細(xì)菌感染、基因敲除的小鼠腸道炎癥疾病模型已經(jīng)廣泛用于科學(xué)研究[6]。C.rodentium誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型病理特征類似于人類炎癥性腸炎，主要癥狀包括結(jié)腸充血、直腸出血，水腫、腹瀉，腸上皮屏障破壞、隱窩結(jié)構(gòu)破壞、杯狀細(xì)胞丟失，黏膜組織炎性細(xì)胞浸潤[7]。這種模型可重復(fù)性好、成功率高，是目前主要應(yīng)用于腸炎研究的模型。從本實驗結(jié)果可以看出，常氧環(huán)境中被C.rodentium感染導(dǎo)致小腸長度縮短，低氧暴露下更為顯著。低氧暴露可造成感染組小鼠結(jié)腸組織上皮損傷、糜爛，固有腺體排列紊亂，黏膜和黏膜下層可見大量炎性細(xì)胞浸潤。

本研究成功建立由C.rodentium誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，通過此模型研究發(fā)現(xiàn)低氧暴露可以加劇炎癥性結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展。

3.2 低氧暴露對小鼠中性粒細(xì)胞的影響

中性粒細(xì)胞來源于骨髓，發(fā)揮非特異性免疫防疫作用并參與機(jī)體的免疫應(yīng)答及炎癥損傷。中性粒細(xì)胞依靠強(qiáng)大的氧化暴發(fā)能力產(chǎn)生破壞病原體的效應(yīng)分子，包括氧自由基和氯衍生物[8]。此外，中性粒細(xì)胞吞噬體內(nèi)的蛋白質(zhì)水解酶活性較高。因此，與其他免疫細(xì)胞相比，中性粒細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原降解能力。在病原體入侵中性粒細(xì)胞的早期階段，吞噬體膜上大量募集的NOX2使吞噬體內(nèi)部pH水平變化，產(chǎn)生活性氧[9]。ROS是免疫細(xì)胞發(fā)揮吞噬和殺傷作用的主要介質(zhì)。另外，吞噬體中的MPO可催化超氧化物轉(zhuǎn)化為多種對微生物有降解和殺滅作用的分子，如次氯酸、氯、氯胺、羥基等[10]。最終中性粒細(xì)胞吞噬體內(nèi)部的蛋白質(zhì)水解酶活性增強(qiáng)，發(fā)揮較強(qiáng)的降解和殺滅病原體的能力。氧的不足導(dǎo)致中性粒細(xì)胞內(nèi)部NOX2募集不足使活性氧產(chǎn)生不足，進(jìn)而導(dǎo)致清除病原體能力下降。另外，本研究結(jié)果顯示，低氧可造成中性粒細(xì)胞趨化性降低。中性粒細(xì)胞趨化性降低使得清除病原體的中性粒細(xì)胞參與率下降，造成小鼠結(jié)腸感染癥狀加重。

3.3 低氧暴露對小鼠巨噬細(xì)胞(MΦ)的影響

MΦ為腸道的主要吞噬細(xì)胞，與炎癥性腸炎的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[11]。MΦ主要依靠形成吞噬體來清除病原體，吞噬體是胞吞過程中在被吞噬物質(zhì)周圍形成由細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)凹陷而成的囊泡結(jié)構(gòu)，是免疫過程中MΦ常見的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其功能為殺滅和降解入侵機(jī)體的病原微生物，并對相關(guān)抗原進(jìn)行加工提呈。Anne-Marie等[12]證明吞噬體在成熟過程中需與溶酶體融合，生成兼具隔離與分解異己物質(zhì)能力的吞噬溶酶體。炎癥性腸炎急性期腸黏膜中MΦ量明顯增加，且表達(dá)相當(dāng)數(shù)量的T細(xì)胞共刺激分子(CD40、CD80、CD86等)。同時，TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)，且共表達(dá)CD14、CD89和髓系細(xì)胞觸發(fā)受體-1(TREM-1)[13]。TREM-1可觸發(fā)促炎因子的合成與分泌，包括TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8等，造成局部組織破壞。這與我們的研究結(jié)果一致。

MΦ吞噬功能的發(fā)揮主要依賴于吞噬體膜上V-ATPase的高效募集[14，15]，進(jìn)而迅速導(dǎo)致吞噬體內(nèi)部pH水平變化，最終增強(qiáng)降解抗原和殺滅病原微生物的能力。MΦ細(xì)胞質(zhì)膜上大量募集的NOX2 產(chǎn)生的ROS 可導(dǎo)致組織炎癥[16]。病原體侵入MΦ的早期階段，大量的V-ATPase募集到吞噬體膜上[17]，導(dǎo)致吞噬體腔內(nèi)迅速酸化。有研究發(fā)現(xiàn)，MΦ吞噬抗原后幾分鐘內(nèi)，吞噬體內(nèi)pH值下降[18]。迅速酸化的吞噬體結(jié)合腔內(nèi)大量補(bǔ)充的溶酶體蛋白酶，形成有效降解和殺滅病原體的內(nèi)環(huán)境。由此可見，MΦ主要通過募集V-ATPase促進(jìn)吞噬體內(nèi)部的酸化，激活強(qiáng)大的溶酶體蛋白質(zhì)水解活性殺滅病原體并發(fā)生組織炎癥。但是低氧環(huán)境可造成MΦ的趨化性降低，使機(jī)體清除病原體的功能減弱，病原體在體內(nèi)大量聚集，造成較為嚴(yán)重的炎癥損傷。

另外，MΦ的代謝特征以糖酵解為主，其促炎功能的發(fā)揮依賴于糖酵解通量的增加[19]。文獻(xiàn)報道，LPS和IFN-γ誘導(dǎo)的MΦ糖酵解能力顯著增強(qiáng)[20]。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)是一種異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞適應(yīng)氧氣變化起到關(guān)鍵作用，HIF-1α作為HIF-1活性亞基是其發(fā)揮功能的主要部分[21]。HIF-1α靶基因非常廣泛，其中包括多種糖酵解酶，如GLUT1等[22]?；罨腗Φ可通過將其代謝途徑轉(zhuǎn)向糖酵解途徑來適應(yīng)炎癥因子的刺激，低氧環(huán)境可以使HIF-1α顯著上調(diào)[23]，使活化的MΦ轉(zhuǎn)向糖酵解途徑來適應(yīng)炎癥反應(yīng)。

近年來的研究顯示，IBD的發(fā)病與固有免疫缺陷相關(guān)，它的發(fā)展與固有免疫系統(tǒng)所介導(dǎo)的炎癥密切相關(guān)。腸道黏膜屏障的損傷、腸道菌群的紊亂、固有免疫細(xì)胞的失調(diào)、固有免疫相關(guān)分子和基因缺陷等均對IBD的發(fā)生、發(fā)展起到重要的作用。作為結(jié)腸固有免疫的重要組成角色，受低氧條件影響，中性粒細(xì)胞和MΦ所發(fā)揮功能與常氧條件下細(xì)胞功能有所差異。在低氧環(huán)境中，我們發(fā)現(xiàn)低氧暴露可以降低小鼠巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的趨化性，導(dǎo)致小鼠固有免疫功能降低、感染癥狀和病理反應(yīng)加重。