廖立凡 李昱 楊琳 楊欣

顳下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular joint, TMJ)為全身最復(fù)雜的關(guān)節(jié)之一。TMJ髁突軟骨由表及里分為纖維層、增殖層、成熟層、肥大層和鈣化層[1]。軟骨細胞是髁突軟骨中唯一的細胞類型。研究表明，軟骨細胞，尤其是肥大層軟骨細胞的一種亞類，可以轉(zhuǎn)化為髁突軟骨下骨細胞，而非之前認為的肥大軟骨細胞凋亡繼之被骨髓細胞浸入[2]。軟骨基質(zhì)主要成分是II型膠原(Col2a)、蛋白多糖(aggrecan)，二者由軟骨細胞分泌[3]。

Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2(runt-related transcription factor-2,Runx2)是Runt轉(zhuǎn)錄因子家族成員。在成骨細胞分化過程中起著至關(guān)重要的作用[4-5]。研究表明，Runx2在軟骨細胞肥大和骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)的發(fā)展中也起重要作用[6-7]。然而，有關(guān)Runx2對出生后髁突軟骨成熟分化和生物力學的作用尚不清楚。因此，本研究創(chuàng)建了Runx2Agc1CreER小鼠模型，研究Runx2軟骨細胞特異性刪除對出生后小鼠TMJ髁突軟骨細胞的肥大分化過程以及對其生物力學性能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

中科院深圳先進技術(shù)研究院提供Agc1-CreER和Runx2f/f小鼠，培育Agc1-CreER,ROSAmT/mG小鼠和Agc1-CreER,Runx2flox/flox(Runx2Agc1CreER，實驗組)條件性敲除小鼠。在小鼠5 周齡時進行他莫昔芬腹腔注射(SigmaT5648, 上海，1 mg/10 g·d，持續(xù)5 d)，并在小鼠9 周齡或13 周齡時取材進行組織學分析。Cre陰性同窩小鼠(Cre-)作為對照組。每組各13 只小鼠。

1.2 Cre重組效率

為了確認Agc1-CreER小鼠可以有效靶向成年小鼠髁突軟骨細胞，將Agc1-CreER轉(zhuǎn)基因小鼠與ROSAmT/mG報告基因小鼠進行繁殖。在小鼠5 周齡時腹腔注射他莫昔芬，在小鼠9 周齡時取材并制作冰凍切片，使用熒光顯微鏡觀察冰凍組織切片。

1.3 組織學觀察

收集Runx2Agc1CreER小鼠及其對應(yīng)的Cre-小鼠的TMJ。將TMJ進行固定、脫鈣、脫水、包埋等組織前期處理后，從TMJ髁突的內(nèi)側(cè)，分為3 個不同的層次(相距50 μm)切下3 μm厚的矢狀連續(xù)切片，分別用蘇木精伊紅(HE)和阿爾新藍/橘紅(AB/HO)(AB/HO)方法進行切片染色。

1.4 免疫組化

將組織切片分別用抗Runx2(MBL，貨號D130-3，沃本，美國，1∶200)、ColX(Abcam，貨號ab58632， 1∶1000稀釋度)、IHH(Abcam，貨號ab39634， 1∶500)、PCNA(Abcam，貨號ab18197， 1∶4000， 英國)一抗工作液進行免疫組化染色， 4 ℃孵育過夜。

1.5 納米模量檢測

取材后將組織保存在含有蛋白酶抑制劑的4 ℃ 1×PBS中來使組織蛋白的降解最小化，然后用納米壓痕檢測技術(shù)進行檢測。納米壓痕檢測是用硼硅酸鹽膠體球形探頭和標尺對關(guān)節(jié)軟骨表面進行檢測。最后檢測的結(jié)果用彈性模量(Eind)來表示， Eind增高說明組織的承力能力增強， Eind降低說明組織的承力能力減弱。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 Agc1-CreER能夠高效靶向表達于TMJ髁突軟骨細胞

將Agc1-CreER和ROSAmT/mG轉(zhuǎn)基因小鼠進行雜交得到Agc1-CreER,ROSAmT/mG小鼠。在小鼠5 周齡時進行他莫昔芬注射，在小鼠9 周齡和13 周齡時取材進行冰凍切片觀察。結(jié)果顯示，Cre-小鼠的TMJ髁突軟骨中只有紅色熒光信號，而Agc1-CreER,ROSAmT/mG小鼠的TMJ髁突軟骨中有廣泛的綠色熒光信號，這提示Agc1-CreER能夠高效靶向TMJ髁突軟骨細胞(圖 1)。此外，Agc1-CreER,ROSAmT/mG小鼠髁突軟骨下骨中也出現(xiàn)綠色熒光信號表達。

圖 1 Agc1-CreER在髁突軟骨細胞中的表達(熒光顯微鏡, n=3)

2.2 Runx2敲除引起小鼠髁突軟骨細胞分化缺陷

HE染色顯示，Cre-小鼠的TMJ髁突軟骨細胞排列有序，由表及里分為纖維層、增殖層、成熟層、肥大層、鈣化軟骨層(圖 2)；而Runx2Agc1CreER小鼠髁突軟骨細胞的有序排列被破壞，肥大層幾乎完全缺失，增殖層和成熟層細胞密度也顯著降低(圖 2)。Cre-小鼠TMJ髁突軟骨的潮標(非鈣化和鈣化軟骨區(qū)的交界線)不明顯，而9 周齡和13 周齡Runx2Agc1CreER小鼠TMJ髁突軟骨的潮標變得非常明顯(圖 3，白色箭頭)。除此之外，阿爾新藍/橘紅染色結(jié)果表明，Runx2Agc1CreER小鼠TMJ髁突軟骨中阿爾新藍的染色強度顯著降低(圖 3)， 表明Runx2Agc1CreER小鼠髁突軟骨免疫組化(IHC)染色評估了Runx2在Runx2Agc1CreER小鼠的TMJ髁突軟骨中的敲除效率。Cre-小鼠髁突軟骨的成熟層和肥大層中可以檢測到大量Runx2表達，而Runx2Agc1CreER小鼠的相應(yīng)區(qū)域幾乎沒有Runx2的陽性表達(圖 4A)。Cre-鼠髁突軟骨層中ColX蛋白表達豐富，而Runx2Agc1CreER小鼠的相應(yīng)區(qū)域ColX表達顯著降低(圖 4A)。IHH在Cre-小鼠髁突軟骨層中表達豐富，而在Runx2Agc1CreER小鼠該區(qū)域表達顯著降低。與此一致，Cre-小鼠髁突軟骨細胞可大量檢測到PCNA表達， 而Runx2Agc1CreER小鼠髁突軟骨層細胞中PCNA的表達顯著降低(圖 4B)。

圖 2 Cre-小鼠髁突軟骨分層(HE)

圖 3 髁突軟骨蛋白聚糖表達 (HE-伊紅-阿爾新藍/橘紅染色， n=5)

圖 4 髁突軟骨中相關(guān)蛋白表達 (IHC， n=5)

2.3 Runx2敲除引起小鼠髁突軟骨彈性模量增高

在小鼠6 周齡時進行他莫昔芬腹腔連續(xù)注射5 d，劑量為1 mg/10 g。 在小鼠9 周齡后進行取材，分別對Cre-小鼠和Runx2Agc1CreER小鼠的TMJ髁突進行彈性模量(Eind)檢測(n=4)。Cre-組和Runx2Agc1CreER組的Eind(MPa)分別為0.089 8和0.762 0(P<0.05), 表明敲除出生后小鼠軟骨中Runx2基因引起小鼠的髁突軟骨硬度上升、力學性能增強。

3 討 論

髁突表面覆蓋著軟骨層，髁突軟骨層可緩沖作用于髁突上方的作用力。軟骨組織結(jié)構(gòu)的改變會直接影響其力學承載能力。阿爾新藍/橘紅染色可以將蛋白聚糖或糖胺聚糖染成藍色或紫色。聚集蛋白聚糖主要位于肥大層和成熟層[8-9]。與此一致，我們發(fā)現(xiàn)阿爾新藍陽性染色細胞主要位于Cre-小鼠的TMJ髁突軟骨的肥大層，這表明肥大層軟骨細胞是TMJ髁突軟骨中產(chǎn)生蛋白聚糖的主要細胞。另外，在Runx2Agc1CreER小鼠中，由于肥大軟骨層的喪失，阿爾新藍陽性染色在鈣化軟骨層中才能檢測到。

軟骨細胞過度肥大分化在OA的起始和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。在軟骨發(fā)育過程中，Runx2控制肥大層軟骨細胞的成熟和終末分化，以及軟骨內(nèi)骨形成過程中的鈣化和血管浸潤[11-12]。此外，Runx2還通過軟骨細胞肥大和基質(zhì)分解影響關(guān)節(jié)不穩(wěn)定誘導(dǎo)的OA的發(fā)病過程[7,11]。軟骨細胞中Runx2的缺失降低了成年小鼠OA進展[6]。在本研究中，條件性敲除小鼠軟骨細胞中Runx2的表達抑制了軟骨細胞肥大分化，并引起增殖層軟骨細胞以及軟骨基質(zhì)產(chǎn)生減少。這表明持續(xù)的Runx2表達對于協(xié)調(diào)和維持出生后小鼠軟骨細胞正常分化至關(guān)重要。免疫組化結(jié)果顯示，隨著Runx2的敲除，軟骨層中與軟骨細胞肥大分化相關(guān)的ColX、IHH表達均下降[13-16]。

力學性能是軟骨功能的直接指標[17-18]。有研究報道，小鼠軟骨彈性模量的降低是術(shù)后骨關(guān)節(jié)炎起始和發(fā)展的敏感指標[19],隨后髁突軟骨表面結(jié)構(gòu)和其力學性能的關(guān)系也逐漸被重視[20]。本研究的生物力學檢測(髁突軟骨的彈性模量)發(fā)現(xiàn)，Runx2Agc1CreER小鼠的髁突軟骨彈性模量高于Cre-小鼠，表明敲除鼠的髁突軟骨硬度上升、力學性能增強。這提示，Runx2的減少在一定程度上能夠緩解TMJ-OA髁突力學性能的下降。Runx2和ColX是軟骨內(nèi)成骨的重要調(diào)控因子及標志物，它們的表達水平反映了TMJ生長和改建的情況[21]。不同作用方式、作用時間的下頜前伸力差異性調(diào)節(jié)髁突軟骨細胞Runx2及ColX的表達水平。與持續(xù)性、靜止性下頜前伸力相比，間歇性、周期性下頜前伸力顯著增加了髁突軟骨Runx2及ColX表達水平[21]。而本研究Runx2軟骨敲除鼠髁突軟骨的Runx2和ColX表達降低，導(dǎo)致了髁突彈性模量增高，承力作用增強。這些結(jié)果表明髁突軟骨肥大分化和力學性能改變之間存在相互作用。

綜上所述，在本研究發(fā)現(xiàn)敲除出生后小鼠軟骨細胞Runx2導(dǎo)致TMJ髁突肥大軟骨層丟失，軟骨基質(zhì)蛋白多糖表達降低，肥大分化相關(guān)蛋白表達降低；髁突軟骨彈性模量值上升。這表明，持續(xù)的Runx2表達能夠協(xié)調(diào)和維持出生后小鼠髁突軟骨細胞的正常肥大分化過程，對該過程的干擾會影響髁突軟骨細胞的正常分化和有序排列，以及髁突軟骨細胞的細胞外基質(zhì)分泌功能，進而導(dǎo)致髁突力學性能改變。軟骨細胞的過度肥大分化是OA進展的重要促進因素，而且關(guān)節(jié)軟骨承力作用的下降也是OA的敏感指標[19]。因此，本研究結(jié)果也提示，如果在TMJ OA軟骨中減少Runx2的表達有可能會延緩或部分逆轉(zhuǎn)TMJ OA的髁突軟骨退變進程。