周 興， 陸艷青， 彭建平， 王傳東， 張曉玲

在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎等慢性炎癥性疾病中，骨破壞和骨丟失嚴(yán)重。近年來，不少研究表明免疫系統(tǒng)與骨代謝之間具有關(guān)聯(lián)性[1]，M2巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等可通過增強(qiáng)成骨分化或抑制破骨細(xì)胞分化成熟等方式來加強(qiáng)成骨[2-3]。相反，活化的T細(xì)胞可通過分泌一系列促炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)等激活經(jīng)典的破骨細(xì)胞活化通路，包括核因子-κB配體的受體激活劑(receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)、Wnt/β-catenin等。促炎性細(xì)胞因子在炎癥和骨質(zhì)疏松之間起到中間介質(zhì)作用，目前已經(jīng)有很多研究以促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6作為靶點(diǎn)開發(fā)治療骨代謝疾病的藥物[2，4-6]。非編碼RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)可根據(jù)其長度分為長非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)和非編碼小RNA(small non-coding RNAs，sncRNAs)。lncRNAs的長度超過200個核苷酸，可包含數(shù)千個核苷酸。sncRNAs的長度<200個核苷酸，包括小干擾RNA(small interfering RNAs，siRNAs)、PIWI相互作用RNA(PIWI-interacting RNAs，piRNAs)、微小RNA(microRNA,miRNAs)、核仁小RNA(small nucleolar RNAs,snoRNAs)和核小RNA(small nuclear RNA，snRNAs)等[7]。目前，sncRNAs尤其是miRNAs在許多人類疾病中的作用已經(jīng)得到了廣泛驗證。然而，目前尚未有研究報道TNF-α對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)中sncRNAs的調(diào)控作用。本研究通過TNF-α刺激hBMSCs，利用高通量測序以及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分析TNF-α對hBMSCs中sncRNAs表達(dá)的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗材料 DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司(#SH30081.01)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自BIOEXPLORER公司(#BN1630-149)；人血小板裂解液購自以色列BI公司(# PLTGOLD050R)；胰蛋白酶購自Gibco公司(#25200072)；TNF-α細(xì)胞因子購自PeproTech公司(#315-01A)；miRNAs加尾法試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司(# B532451-0020)；實(shí)時熒光定量PCR相關(guān)試劑[TB Green? Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)、PrimeScriptTMRT Master Mix]購自日本Takara公司(# RR420A、#RR036A)。

1.2hBMSCs分離和培養(yǎng) 選擇2021年8月至2021年10月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院骨科接受手術(shù)治療的先天性髖關(guān)節(jié)發(fā)育不良患者5例，均經(jīng)骨盆正位片確診。通過全骨髓血貼壁法分離、培養(yǎng)hBMSCs。從髂骨穿刺抽取骨髓血5～10 ml，立即加入肝素鈉上下顛倒5次防止凝血，轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中，加入完全培養(yǎng)基(含8% FBS、2%人血小板裂解物的高糖DMEM)，細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)10 d左右即可獲得原代hBMSCs。本項研究獲得了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批號：XHEC-C-2021-125-1)，所取樣本獲得了捐贈者的知情同意。

1.3small RNAs測序 選擇P2代hBMSCs，以2×105cells/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至70%融合后棄除舊的培養(yǎng)基。對照組繼續(xù)加入完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，TNF-α組加入含有10 ng/ml TNF-α的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每組3個復(fù)孔。經(jīng)干預(yù)24 h后棄去6孔板中的培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2遍，每個孔加入1 ml TRIzol試劑裂解細(xì)胞，樣品置于干冰保存，重復(fù)3次實(shí)驗。所得樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行總RNA提取、建庫和small RNAs測序。

1.4實(shí)時熒光定量PCR 應(yīng)用TRIzol法提取hBMSCs總RNA，將RNA稀釋至500 ng/μl。取2 μl RNA使用miRNAs加尾法試劑盒進(jìn)行miRNAs和piRNAs逆轉(zhuǎn)錄。使用PrimeScriptTMRT Master Mix進(jìn)行snoRNAs和snRNAs逆轉(zhuǎn)錄。使用TB Green? Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)試劑在羅氏LightCycler 480儀上進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，miRNAs和piRNAs使用試劑盒中的U6作為內(nèi)參，Universal R引物作為通用R引物；snoRNAs和snRNAs使用GAPDH作為內(nèi)參。本實(shí)驗選用的引物序列見表1。所有引物均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗，采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。

表1 PCR所用引物序列

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Graphpad Prism 8.2.1軟件作圖。兩組間計量資料比較采用成組t檢驗。在R軟件(3.3.0)中，熱圖使用gplots函數(shù)繪制，MA圖(M-versus-A plot)、Scatter圖(Scatter plot)、火山圖(Volcano plot)使用ggplot2函數(shù)繪制，主成分分析(principal component analysis，PCA)使用vegan函數(shù)繪制。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下miRNAs的表達(dá) small RNAs測序分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中miRNAs表達(dá)存在顯著變化(見圖1?)。MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中有38個miRNAs表達(dá)顯著上調(diào)，11個miRNAs表達(dá)顯著下調(diào)(見圖1?～?)。PCA結(jié)果顯示，miRNAs的表達(dá)可以區(qū)分對照組和TNF-α組hBMSCs(見圖1?)。選取測序結(jié)果有顯著性差異的miRNAs進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，在TNF-α組中hsa-miR-141-3p、hsa-miR-3065-5p、hsa-novel-155-mature、hsa-miR-27a-5p表達(dá)顯著下降(P<0.05)，而hsa-novel-170-mature、hsa-miR-155-5p、hsa-miR-1260a、hsa-novel-202-mature、hsa-novel-116-mature表達(dá)顯著上升(P<0.05)(見圖1?)。

2.2TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下piRNAs的表達(dá) small RNAs測序分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中piRNAs表達(dá)存在顯著變化(見圖2?)。MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中有25個piRNAs表達(dá)顯著上調(diào)，有24個piRNAs表達(dá)顯著下調(diào)(見圖2?～?)。PCA結(jié)果顯示，piRNAs的表達(dá)可以區(qū)分對照組和TNF-α組hBMSCs(見圖2?)。選取有顯著性差異的piRNAs進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組DQ592932、DQ570992、DQ593325、DQ582827表達(dá)顯著上升(見圖2?)。

2.3TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下snoRNAs的表達(dá) small RNAs測序分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中snoRNAs表達(dá)存在顯著變化(見圖3?)。MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中有40個snoRNAs表達(dá)顯著上調(diào)，有24個snoRNAs表達(dá)顯著下調(diào)(見圖3?～?)。PCA結(jié)果顯示，snoRNAs的表達(dá)可以區(qū)分對照組和TNF-α組hBMSCs(見圖3?)。選取有顯著性差異的snoRNAs進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中SNORD14D、SNORD116-3、SNORA21、SNORD60、SNORD81、SNORD32A、SNORD117、SNORD2、SNORD1C、SNORD36B、SNORD4B、SNORA58、SNORA64表達(dá)顯著下降(見圖3?)。

2.4TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下snRNAs的表達(dá) small RNAs測序分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中snRNAs表達(dá)存在顯著變化(見圖4?)。MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中有5個snRNAs表達(dá)顯著上調(diào)，有8個snRNAs表達(dá)顯著下調(diào)(見圖4?～?)。PCA結(jié)果顯示，snRNAs的表達(dá)可以區(qū)分對照組和TNF-α組hBMSCs(見圖4?)。選取有顯著性差異的snRNAs進(jìn)行PCR驗證，結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組NR_003137.2表達(dá)顯著下降(見圖4?)。

?熱圖分析結(jié)果；?MA圖分析結(jié)果；?Scatter圖分析結(jié)果；?火山圖分析結(jié)果；?PCA結(jié)果；?實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果，*P<0.05，***P<0.001。CPM：每百萬計數(shù)(count-per-millon)

?熱圖分析結(jié)果；?MA圖分析結(jié)果；?Scatter圖分析結(jié)果；?火山圖分析結(jié)果；?PCA結(jié)果；?實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

?熱圖分析結(jié)果；?MA圖分析結(jié)果；?Scatter圖分析結(jié)果；?火山圖分析結(jié)果；?PCA結(jié)果；?實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果，*P<0.05，**P<0.01

?熱圖分析結(jié)果；?MA圖分析結(jié)果；?Scatter圖分析結(jié)果；?火山圖分析結(jié)果；?PCA結(jié)果；?實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果，**P<0.01

2.5TNF-α調(diào)控hBMSCs炎癥狀態(tài)下repeat RNAs的表達(dá) 根據(jù)small RNAs測序分析結(jié)果，MA圖、Scatter圖和火山圖分析結(jié)果顯示，與對照組相比，TNF-α組中有1個repeat RNA表達(dá)顯著下調(diào)(見圖5?～?)。PCA結(jié)果顯示repeat RNAs的表達(dá)可以區(qū)分對照組和TNF-α組hBMSCs(見圖5?)。

?MA圖分析結(jié)果；?Scatter圖分析結(jié)果；?火山圖分析結(jié)果；?PCA結(jié)果

3 討論

3.1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等多種骨關(guān)節(jié)退行性疾病中，局部微環(huán)境中的炎癥因子通過抑制成骨分化、促進(jìn)破骨形成等多種途徑加劇骨侵蝕破壞，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)損傷程度[1，8]。炎癥與骨重塑相關(guān)細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等之間的相互作用和調(diào)控關(guān)系對于退行性骨病治療策略的開發(fā)意義重大[9-10]。本研究主要關(guān)注了炎癥刺激對于間充質(zhì)干細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)改變，尤其是sncRNAs表達(dá)水平的變化。間充質(zhì)干細(xì)胞具有多項分化潛能并且是成骨的主要來源[11]。

3.2本研究應(yīng)用高通量small RNAs測序技術(shù)分析4類sncRNAs表達(dá)水平的改變情況，并應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行了驗證。miRNAs是一類長度約為22個核苷酸片段的sncRNAs，主要通過和靶基因mRNA 3′-UTR區(qū)結(jié)合[12-13]，導(dǎo)致mRNA降解或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯，進(jìn)而影響靶基因的蛋白表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，TNF-α可以抑制hsa-miR-27a-5p的表達(dá)，既往研究報道也顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分泌的外泌體中富含hsa-miR-27a-5p，其可通過靶向自噬相關(guān)蛋白4同源物B(autophagy-related protein 4 homolog B,Atg4B)介導(dǎo)BMSCs自噬，促進(jìn)BMSCs的成骨分化[14]。因此，認(rèn)為TNF-α可能通過抑制BMSCs中hsa-miR-27a-5p的表達(dá)而抑制其成骨分化。miR-155-5p可通過抑制E26轉(zhuǎn)錄因子-1(E26 transformation specific-1,ETS-1)表達(dá)而降低牙周韌帶干細(xì)胞的成骨分化[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以促進(jìn)miR-155-5p的表達(dá)，因此miR-155-5p可能參與了TNF-α對BMSCs成骨分化的調(diào)控。本研究也發(fā)現(xiàn)了TNF-α可以調(diào)控多個miRNAs的表達(dá)，并且測序結(jié)果預(yù)測了4個新的miRNAs：hsa-novel-170-mature、hsa-novel-155-mature、hsa-novel-202-mature、hsa-novel-116-mature。對于這些新的miRNAs目前尚未有研究報道其生物學(xué)功能，炎癥刺激如何調(diào)控這些miRNAs而影響hBMSCs成骨分化需要通過后續(xù)的生物學(xué)實(shí)驗進(jìn)一步驗證。

3.3piRNAs最早是從哺乳動物精子細(xì)胞中分離出來的一類長度為26～32個核苷酸片段的ncRNAs[17]，可以與PIWI家族蛋白相互作用。隨后的研究表明，piRNAs不只存在于生殖細(xì)胞中，在體細(xì)胞中也有廣泛的表達(dá)[18-19]。然而，對于piRNAs的起源和功能目前還沒有完全闡明，隨著對piRNAs研究的深入，目前已有多個可用的數(shù)據(jù)庫[20]。本研究結(jié)果顯示TNF-α可以調(diào)控DQ592932、DQ570992、DQ593325、DQ582827的表達(dá)，其中DQ582827的表達(dá)顯著性升高。由于目前還沒有可靠的piRNAs功能預(yù)測軟件，難以預(yù)測這些piRNAs的靶基因，對于炎癥刺激后piRNAs的改變是否會影響hBMSCs成骨分化，以及其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3.4snoRNAs是一類主要分布在核仁的長度為60～300個核苷酸片段的sncRNAs，其主要的功能是調(diào)控核糖體RNA的修飾[21]。目前尚未有研究報道snoRNAs對hBMSCs成骨分化有直接調(diào)控作用。有研究報道snoRNAs宿主基因如SNHG16可通過調(diào)控骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)的表達(dá)介導(dǎo)hBMSCs成骨分化[22]，SNHG14通過調(diào)控miR-185-5p/WISP2信號通路促進(jìn)hBMSCs成骨分化[23]。本研究結(jié)果顯示，TNF-α刺激后hBMSCs中SNORD14D、SNORD116-3、SNORA21、SNORD60、SNORD81、SNORD32A、SNORD117、SNORD2、SNORD1C、SNORD36B、SNORD4B、SNORA58、SNORA64的表達(dá)顯著下降，然而這些snoRNAs對BMSCs的表觀遺傳學(xué)修飾作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)TNF-α參與調(diào)控多個snRNAs和repeat RNAs。但局限于目前piRNAs、snoRNAs、snRNAs、repeat RNAs等ncRNAs功能預(yù)測工具較少、數(shù)據(jù)庫分類不統(tǒng)一，以及相應(yīng)的生物學(xué)方法如過表達(dá)或敲低等還不成熟，其作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步驗證，該領(lǐng)域的研究進(jìn)展值得我們繼續(xù)關(guān)注。

綜上所述，本研究通過高通量small RNAs轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序揭示了炎癥因子TNF-α影響hBMSCs表觀遺傳學(xué)修飾中sncRNAs的表達(dá)。對于這些sncRNAs的研究將有助于更加深入地理解炎癥因子動態(tài)調(diào)控hBMSCs分化的機(jī)制，為開發(fā)疾病治療的新方法提供參考。