關(guān)璐璐， 韓松峰， 李世朋， 王夢姣， 邵曉亞， 喬兵兵， 席守民

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球發(fā)病率排名第六，病死率排名第二的惡性腫瘤[1]。HCC細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響HCC治療療效的重要因素[2]。因此，挑選鑒定HCC侵襲和轉(zhuǎn)移新靶點對于前期診斷、選擇治療方式及評估預(yù)后極為重要[3]。高通量RNA測序技術(shù)以高通量、低成本、高精確度[4]、信息量豐富等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于白血病、乳腺癌[5]等疾病的臨床研究，在追蹤細胞譜系、揭露腫瘤細胞的異質(zhì)性、探究腫瘤演變復(fù)雜機制的研究中發(fā)揮著重要作用[6]。肝癌高表達轉(zhuǎn)錄本(highly up-regulated in liver cancer,HULC)作為長鏈非編碼RNA(long non-coding ribonucleic acids,lncRNAs)的一員[7]，可促進腫瘤細胞生長[8]和血管的生成[9]。因此，異常表達的lncRNA HULC與HCC細胞的分化、增殖和侵襲功能相關(guān)[10]。關(guān)于lncRNA HULC對HCC細胞微小RNA(micro ribonucleic acid,miRNA)差異表達譜及競爭內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響研究較少。鑒此，本研究通過分析敲低lncRNA HULC，研究HCC的差異表達miRNA和ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探索其在HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和意義?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗細胞 選擇人HCC細胞株BEL-7402作為實驗對象，購自豐暉生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。高糖培養(yǎng)基DMEM購于CORNING公司。引物合成于上海生工有限公司?？俁NA提取試劑盒購于上海Promega公司。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Novoprotein公司。miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa生物公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 使用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基作為完全培養(yǎng)基對BEL-7402細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將siRNA[si-NC(對照組)和si-HULC(模型組)]轉(zhuǎn)染至BEL-7402細胞。將非靶向siRNA(si-NC)作陰性對照轉(zhuǎn)染至BEL-7402細胞。培養(yǎng)箱中孵育6 h，轉(zhuǎn)染后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細胞備檢。

1.2.2 miRNA高通量測序 對BEL-7402細胞進行前期處理，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增，經(jīng)文庫質(zhì)檢后上機測序。并對測序的質(zhì)量進行評估，以得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)。上機測序由上海生工公司進行。通過DESeq2網(wǎng)站對有差異表達的miRNA進行基因集合(Gene Ontology,GO)分析，通過miRDeep2軟件對新miRNA進行預(yù)測。

1.2.3 實時熒光定量PCR 提取BEL-7402細胞的總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將所得總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時熒光定量PCR檢測lncRNA HULC及目的miRNA的表達，引物序列見表1。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中cDNA按照1∶4稀釋后取5 μl，2×SYBR預(yù)混合物10 μl，無RNA酶水5 μl，正、反向引物各0.4 μl。擴增實驗條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，擴增40個循環(huán)。以GAPDH和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA HULC及miRNA的相對表達量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1細胞模型構(gòu)建結(jié)果 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，經(jīng)轉(zhuǎn)染si-HULC后，模型組lncRNA HULC的表達水平較對照組顯著降低，提示細胞模型構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 兩組HULC表達水平圖

2.2差異表達miRNA的篩選及新miRNA預(yù)測結(jié)果 以P<0.05且|log2fold change|≥2為標準，挑選到具有顯著表達差異的miRNA 9個。其中，表達水平顯著升高的miRNA有4個，表達水平顯著降低的miRNA有5個。見表2，圖2。

表2 9個表達差異顯著的miRNA

橫向坐標為遺傳因子在不同組樣本間的差異性表達倍數(shù)fold change[log(B/A)]值，縱向坐標代表遺傳因子表達量變化的統(tǒng)計顯著性程度，P value越小，-log(P value)越大，差異越明顯。圖中的每個點分別代表一個遺傳因子，其中紅色表示遺傳因子上調(diào)，綠色表示遺傳因子下調(diào)，黑色表示非差異遺傳因子

2.3實時熒光定量PCR驗證差異miRNA表達結(jié)果 實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，所篩選得的差異miRNAs：hsa-let-7i-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-3200-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-548q在兩組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 實時熒光定量PCR驗證差異miRNA表達圖

2.4新miRNA預(yù)測結(jié)果 基于參考基因組，使用miRDeep2軟件進行新miRNA預(yù)測，miRDeep2打分，分值越高結(jié)果越好。得分前15的新miRNA預(yù)測結(jié)果見表3。

2.5差異miRNA靶基因功能富集分析結(jié)果 結(jié)果顯示，表達下調(diào)的miRNA的靶基因的分子功能與絲氨酸t(yī)RNA連接酶活性、蛋白激酶活性、陽離子通道活性、14-3-3蛋白結(jié)合、鈣轉(zhuǎn)運ATP酶活性等有關(guān)；表達上調(diào)的miRNA的靶基因與硒代半胱氨酸裂解酶活性、維生素B6結(jié)合、過氧化物酶體機制靶向信號1結(jié)合、鎳陽離子結(jié)合、過氧化物酶體靶向序列結(jié)合、蛋白質(zhì)N-末端結(jié)合、腫瘤壞死因子受體超家族結(jié)合等有關(guān)。見圖4，5。

2.6miRNA-靶基因互作網(wǎng)絡(luò)圖 互作網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果顯示，hsa-let-7i-3p分別與基因ENSG00000140368、ENSG00000132507、ENSG00000182606等7個基因之間存在互作關(guān)系。hsa-miR-122-5p分別與ENSG00000088876、ENSG00000137944、ENSG00000131899等7個基因之間存在互作關(guān)系。hsa-miR-143-3p與基因ENSG00000090863和ENSG00000115159之間存在互作關(guān)系。hsa-miR-214-3p分別與ENSG00000090863、ENSG00000115159、ENSG00000075340等34個基因之間存在互作關(guān)系。見圖6。

2.7差異表達miRNA的靶基因功能富集關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 靶基因功能富集關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，GO：0021759功能富集程度高與差異miRNA的靶基因ENSG00000080815、ENSG00000139197、ENSG00000096093等關(guān)聯(lián)性強。GO：0070588功能富集程度高與差異miRNA的靶基因ENSG00000196296、ENSG00000074370、ENSG00000155886等關(guān)聯(lián)性強。見圖7。

表3 新miRNA預(yù)測統(tǒng)計表

?表達下調(diào)miRNA；?表達上調(diào)miRNA。橫向坐標為功能分類，縱向坐標為該分類內(nèi)遺傳因子數(shù)量(右)及其占被注釋上遺傳因子總數(shù)量的百分比(左)。不同功能分別采用顏色差異區(qū)分(藍色：分子功能。綠色：細胞成分。紅色：生物過程)。

?表達下調(diào)的miRNA；?表達上調(diào)的miRNA。功能注釋信息用縱向坐標表示，功能相對應(yīng)的rich factor(注釋到該功能的差異的遺傳因子數(shù)目比注釋到該功能的遺傳因子數(shù)目)用橫向坐標表示，用點的顏色來表示Q value的大小，顏色越接近紅色表明Q value越小，用點的大小對每個功能所涵蓋的差異的遺傳因子的多少進行表示。

圖中靶基因用方形節(jié)點表示，miRNA用圓形節(jié)點表示，靶基因與miRNA的關(guān)聯(lián)性以邊表示。節(jié)點的大小與該節(jié)點的度值(degree)呈正比，即節(jié)點越大，與此節(jié)點相連的邊越多。

圖中圓形節(jié)點為功能信息，邊代表功能間的關(guān)聯(lián)性。節(jié)點的顏色代表功能的富集程度即P value值，富集程度越高，P value值越低，相應(yīng)顏色越深。

3 討論

近年來研究顯示，lncRNA已經(jīng)成為研究生物標志物及治療靶點的關(guān)鍵點[11]。有研究表明，在lncRNA、mRNA、miRNA組成的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，lncRNA可充當(dāng)ceRNAs網(wǎng)絡(luò)的分子海綿[12]與miRNA互相通信，協(xié)同調(diào)節(jié)mRNA與其靶基因的表達[13]。lncRNA不僅在HCC中表達上調(diào)[14]，在其他癌癥如骨肉瘤[15]、鼻咽癌[16]、乳腺癌[17]和卵巢癌[18]等中也呈高表達。miRNA是內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA[19]，其與靶基因mRNA的3′端結(jié)合，導(dǎo)致其降解或抑制其翻譯，完成對遺傳因子轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[20]。本實驗通過高通量測序?qū)θ薍CC細胞系BEL-7402敲低lncRNA HULC后差異表達的miRNA進行分析，并預(yù)測新miRNA，對其靶基因富集進行GO分析。miRNA作為疾病生物標志物與疾病的發(fā)生具有高度關(guān)聯(lián)性，hsa-let-7i-3p與結(jié)直腸癌的血清外泌體環(huán)橋粒相關(guān)蛋白(pinin,PNN)的表達呈負相關(guān)[21]。因此，提示hsa-let-7i-3p可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在肝細胞中，hsa-miR-122-5p可以下調(diào)三酰基甘油(triacylglycerol,TAG)通路基因CTDNEP1[22]。并且，hsa-miR-122-5p/lncRNA X染色體特異性轉(zhuǎn)錄子(X-inactive specific transcript,XIST)路徑可調(diào)節(jié)腎移植急性腎損傷中反沉默作用蛋白1A(anti-silencing function 1A,ASF1A)的表達。另外，有研究表明，hsa-miR-122-5p作為lncRNA XIST的分子海綿調(diào)節(jié)腎移植、急性腎損傷中組織ASF1A的表達[23]。有研究表明，環(huán)狀RNA circCSNK1G3/hsa-miR-143-3p/同源椎基因A10(homeobox A10,HOXA10)路徑可介導(dǎo)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展[24]。lncRNA XIST結(jié)合hsa-miR-214-3p對上皮性卵巢癌細胞產(chǎn)生抗癌作用[25]。lncRNA HCP5在HCC中高表達，并通過miR-214-3p/肝癌衍生生長因子(hepatoma-derived growth factor,HDGF)路徑參與吉西他濱耐藥及細胞的增殖、侵襲和遷移過程[26]。因此，hsa-miR-214-3p在癌細胞的生物學(xué)功能方面發(fā)揮著重要作用。另外，miR-3200-5p在肺癌患者中高表達[27]。miR-3200-5p/乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制因子1(breast cancer metastasis suppressor 1,BRMS1)路徑，在骨肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有重要意義[28]。hsa-miR-34a及hsa-miR-34b/c位點可被p53激活[29]，在腫瘤中實現(xiàn)細胞周期停滯和細胞凋亡。前期這些研究進一步證實了本研究篩選的差異表達miRNA可影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。但這些miRNA在HCC中的調(diào)控機制仍不明確，需要進一步研究。

綜上所述，hsa-let-7i-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-214-3p、has-miR-3200-5p等對HCC的發(fā)生、增殖及轉(zhuǎn)移可能具有調(diào)節(jié)作用，值得進一步深入探究。新預(yù)測的miRNA在今后的研究過程中更有提示意義。但由于本實驗研究細胞種類有限，需進一步擴大樣本量對結(jié)果進行驗證。