柯秀梅，周文杰，廖麗萍，肖浪浪，施汝欣，王建偉，韓 麗，張定

1.重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，重慶 400016

2.四川科倫藥業(yè)股份有限公司安岳分公司，四川 成都 611137

3.九江學院基礎醫(yī)學院/九江市轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室，江西 九江 332005

4.成都中醫(yī)藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

中醫(yī)藥在疾病治療中具有綜合起效、不良反應小、預后良好的優(yōu)勢，尤其是中藥湯劑，具有隨證加減、運用靈活，能個性化精準給藥的特點。在2019年開始爆發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的防治中，中醫(yī)藥功不可沒。臨床初步證實，清熱解毒解表藥物及方劑如清肺排毒湯、化濕敗毒方、宣肺敗毒顆粒、金花清感顆粒和連花清瘟膠囊等對COVID-19療效確切[1]。此外，黃連解毒湯（Huanglian Jiedu Decoction，HJD）被國家衛(wèi)生健康委員會及各地相關單位陸續(xù)發(fā)布的多個診療方案推薦治療COVID-19重癥期的氣營兩燔證[2]。作為瀉火解毒的經(jīng)典方劑，HJD廣泛用于中醫(yī)臨床[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，HJD能抗肺炎[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、解熱[8-10]、抗血栓[11]和抗動脈粥樣硬化[12]等。然而，味苦和口感差是中藥的共性問題。特別是苦味成分分散度高、難以有效矯味的中藥湯劑/液體制劑[13]，口感差嚴重影響了患者服藥順應性，制約了其臨床應用。為了開發(fā)有效的中藥湯劑/液體制劑矯味劑，本課題組提出基于“霰彈理論”的中藥湯劑掩味的研制思路，篩選出能有效改善中藥如HJD口感的湯劑伴侶劑[14]。然而，有效性與安全性是藥物的基本屬性，是其質(zhì)量控制的核心要義。矯味伴侶劑（輔料）在抑苦掩味的同時，必須以不影響藥物的療效和安全性為前提。本研究以體外抗氧化、解熱、抗炎、急性毒性和腸道菌群的變化，從藥效、毒性和副作用3個方面評價伴侶劑對HJD的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spectra Max i3X酶標儀，美谷分子儀器上海有限公司；BSA124S電子分析天平，德國Sartorius AG公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.2 試劑

黃芩、黃連、黃柏和梔子飲片均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學劉曉芬講師鑒定，為唇形科黃芩屬植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi的干燥根，毛茛科黃連屬植物黃連Coptis chinensisFranch的干燥根莖，蕓香科黃檗屬植物黃柏Phellodendron chinenseSchneid除去栓皮的干燥樹皮，茜草科梔子屬植物梔子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果實。鏈霉素，上海研生生化試劑有限公司，質(zhì)量濃度99%；青霉素，武漢易泰科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)99%。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），批號L2880，Sigma公司。紐甜，鄭州阿爾法化工有限公司，質(zhì)量分數(shù)95%；單甲氧基聚乙二醇-左旋聚乳酸（monomethoxy polyethylene glycol-l-poly lactic acid，mPEG2000-PLLA2000），濟南岱罡生物工程有限公司，批號2019071415；γ-環(huán)糊精（γ-cyclodextrin，γ-CD），鄭州阿爾法化工有限公司，批號2018122505。三羥甲基氨基甲烷鹽酸［tris(hydroxymethyl) aminomethane，Tris-HCl］緩沖液，北京索萊寶科技有限公司，編號ST788。維生素C（vitamin C，VC），北京索萊寶科技有限公司，質(zhì)量濃度99%。

1.3 動物

SPF級昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，SCXK（贛）2008-0003，購自江西省實驗動物中心。所有動物實驗遵循九江學院附屬醫(yī)院倫理委員會有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 HJD的制備

課題組前期研究表明，中藥湯劑抑苦掩味伴侶劑處方（紐甜、mPEG2000-PLLA2000、γ-CD、HJD藥液質(zhì)量比0.028∶0.15∶1.5∶100）能顯著改善HJD的口感[13]。本實驗進一步評價該抑苦掩味伴侶劑處方對HJD藥效和安全性的影響。

2.1.1 HJD藥液 按黃連、黃芩、黃柏、梔子3∶2∶2∶3質(zhì)量比準確稱取各藥味飲片共100 g，混合，加10倍量水浸泡0.5 h，回流提取3次，每次1 h。合并煎液，定容至藥液質(zhì)量濃度為0.2 g/mL（按含生藥量計），即得HJD藥液。

2.1.2 HJD+伴侶劑 按“2.1.1”項方法制備HJD藥液，向其中加入處方量（紐甜、mPEG2000-PLLA2000、γ-CD、HJD藥液質(zhì)量比0.028∶0.15∶1.5∶100）的抑苦掩味伴侶劑，超聲、攪拌，使其溶解或充分分散，即得。

2.2 伴侶劑對HJD體外抗氧化的影響

2.2.1 1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）清除率的檢測 于96孔板中加入190 μL DPPH溶液（0.1 μmol/L甲醇溶液）和10 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（40、20、10 mg/mL）。190 μL DPPH和10 μL蒸餾水為空白對照，混勻后避光震蕩30 min，測定517 nm處的樣品吸光度（A1）值和HJD自身吸光度（A3）值（以甲醇替DPPH溶液）及空白對照組吸光度（A2）值，每組設置3個復孔。測定樣品對DPPH的清除率，計算公式為清除率＝1-(A1-A3)/A2。

2.2.2 超氧陰離子清除率的檢測 向96孔板中加入90 μL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH值為8.2），分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，25 ℃溫育20 min。然后加入6 μL同樣預熱的鄰苯三酚溶液（18 mmol/L）。5 min后加入2 μL鹽酸溶液（10 mmol/L），每組設置3個復孔。測定325 nm處各樣品的吸光度（A1）值，以蒸餾水替樣品的A2和以蒸餾水替鄰苯三酚的A3值。測定樣品對超氧陰離子的清除率。計算公式為清除率＝1-(A1-A3)/A2。

2.2.3 羥自由基清除率的檢測 取系列質(zhì)量濃度的樣品溶液50 μL，加入6 mmol/L H2O2溶液、6 mmol/L硫酸亞鐵溶液和10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各50 μL，37 ℃孵育10 min，測定510 nm處的吸光度（A1）值。以VC為陽性對照（A2），溶劑為空白對照（A3），每組試驗設置3個復孔。測定樣品對羥自由基的清除率，計算公式為清除率＝1-(A1-A3)/A2。

2.2.4 統(tǒng)計學分析 組間差異采用Student’st檢驗，多重檢驗校正采用錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR），Post-hoc檢驗方法選擇Turkey-kramer，sumrank test（非參數(shù)因子克魯斯卡爾-沃利斯秩和檢驗）方法，找到顯著性差異類群，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2.5 伴侶劑對HJD體外抗氧化的影響 結果如表1所示，伴侶劑對HJD體外清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子無顯著性影響，HJD體外抗氧化作用具有劑量相關性。

表1 伴侶劑對HJD體外抗氧化的影響結果 ( , n = 3)Table 1 Effect of companion on antioxidation of HJD in vitro ( , n = 3)

表1 伴侶劑對HJD體外抗氧化的影響結果 ( , n = 3)Table 1 Effect of companion on antioxidation of HJD in vitro ( , n = 3)

與高劑量組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與中劑量組比較：##P＜0.01*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs high dose group; ##P ＜ 0.01 vs medium dose group

樣品 DPPH清除率/% 羥自由基清除率/% 超氧陰離子清除率/%2 mg·mL?1 1 mg·mL?1 0.5 mg·mL?1 2 mg·mL?1 1 mg·mL?1 0.5 mg·mL?1 2 mg·mL?1 1 mg·mL?1 0.5 mg·mL?1 HJD 24.3±0.9 25.7±0.5 24.3±2.8 2.7±0.3 1.6±0.5** 1.3±0.1**## 0.3±0.0 0.3±0.0 0.2±0.0**##HJD+伴侶劑 28.3±0.2 26.0±0.6 22.8±1.9** 1.8±0.1 1.2±0.0 1.0±0.1* 0.3±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0

2.3 伴侶劑對HJD抗二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

昆明小鼠，隨機分為模型組、醋酸潑尼松組（陽性藥，9.1 mg/kg），HJD與HJD+伴侶劑高、中、低劑量組（4.505、2.252、1.126 g/kg）。ig給藥，每天1次，連續(xù)7 d。造模前12 h內(nèi)禁食不禁水，最后一次給藥40 min后，在小鼠左耳廓正、反兩面涂抹二甲苯20 μL，使其致炎，右耳作為空白對照。并用打孔器分別在兩耳的同一部位取下耳片（直徑5.5 mm），稱定質(zhì)量，計算小鼠耳腫脹度和腫脹率。

腫脹度＝左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量

腫脹率＝(左耳質(zhì)量-右耳質(zhì)量)/左耳質(zhì)量

結果見表2。陽性對照（潑尼松）組小鼠耳腫脹度/率顯著低于模型；高劑量組抑苦掩味前后的HJD均能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹率，且與陽性組無顯著性差異；高劑量組抑制耳腫脹率的效果明顯優(yōu)于低劑量組。最重要的是，抑苦掩味前后的HJD療效無顯著差異，表明伴侶劑對HJD抑制二甲苯致耳腫脹的效果無顯著性影響。

表2 伴侶劑對HJD抑制二甲苯致小鼠耳腫脹的影響( , n = 7)Table 2 Effect of companion on inhibition of xyleneinduced ear edema of HJD in mice ( , n = 7)

表2 伴侶劑對HJD抑制二甲苯致小鼠耳腫脹的影響( , n = 7)Table 2 Effect of companion on inhibition of xyleneinduced ear edema of HJD in mice ( , n = 7)

與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與潑尼松組比較：△△P＜0.01；與HJD中劑量組比較：#P＜0.05*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs model group; △△P ＜ 0.01 vs prednisone group; #P ＜ 0.05 vs medium dose of HJD

組別 劑量/(g·kg?1) 腫脹度/mg 腫脹率/%模型 ? 2.8±0.7 45.2±12.4潑尼松 0.009 1 1.5±0.6 19.9±9.5**HJD 4.505 2.4±0.5 23.1±12.7**2.252 2.3±0.3 27.4±9.1*1.126 3.2±0.5 44.2±11.7△△**#HJD+伴侶劑 4.505 2.3±0.4 28.0±9.7*2.252 2.3±0.5 40.0±12.1△△1.126 2.6±0.4 40.6±10.7△△*

2.4 伴侶劑對HJD抗LPS致小鼠高熱的影響

2.4.1 LPS注射液的制備 臨用前以氯化鈉注射液將脂多糖配成20.0 mg/L溶液。

2.4.2 造模與給藥 每日測量小鼠肛溫2次，連續(xù)3 d。實驗前連續(xù)測定3次肛溫，每次間隔60 min，取平均值為基礎體溫（T0）。剔除單次體溫超過38 ℃或2次溫差超過0.5 ℃的小鼠。將符合要求的小鼠隨機分為5組，即對照組、模型組、陽性藥物組、HJD組和HJD+伴侶劑組。對照組和模型組ig給予蒸餾水，HJD組和HJD+伴侶劑組分別ig給予4.5 g/kg HJD和HJD+伴侶劑。給藥1 h后對照組ip氯化鈉注射液，其他各組ip LPS（20 μg/kg）造模致熱。造模10 min后開始測體溫（Ti），并分別于30、60、90、120、180 min時間點監(jiān)測體溫。計算ΔT（ΔT＝Ti-T0），繪制體溫變化ΔT-時間（t）曲線。實驗結束后斷頸處死小鼠。

2.4.3 伴侶劑對HJD抗LPS致小鼠高熱的影響伴侶劑對HJD抗LPS致小鼠發(fā)熱的影響結果見圖1。與對照組相比，模型組小鼠的肛溫在造模10～60 min后顯著升高（P＜0.05）；此后溫度顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，各給藥組均表現(xiàn)出不同程度的解熱作用。造模30 min后，HJD組和HJD+伴侶劑組小鼠體溫均有顯著性差異（P＜0.05），各給藥組間差異性不顯著；造模60～90 min后，HJD組和HJD+伴侶劑組小鼠肛溫顯著低于模型組，且HJD+伴侶劑組的解熱效果略優(yōu)于HJD組，但差異不顯著。并且，模型組小鼠肛溫在造模60 min后下降顯著，120 min后趨于穩(wěn)定；給藥組則在造模120 min后呈上升趨勢，且HJD組和陽性組溫度趨同于模型組，可能與小鼠機體的自愈功能有關。

圖1 伴侶劑對HJD抗LPS致小鼠發(fā)熱的影響 ( , n =10)Fig.1 Effects of companion agent on anti-endotoxininduced fever in mice of HJD ( , n = 10)

2.5 伴侶劑對HJD急性毒性的影響研究

昆明小鼠，適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為HJD高劑量組（37.5 g/kg）、HJD低劑量組（25 g/kg）[15]、HJD+伴侶劑高劑量組、HJD+伴侶劑低劑量組和對照組（蒸餾水）并ig基于相應藥物。給藥前12 h禁食不禁水，觀察7 d，記錄受試動物的中毒癥狀、行為和死亡情況，計算死亡率；第7天傍晚禁食不禁水，次日早上行眼眶取血，分離血清，測定血糖、尿素氮、肌酐和白蛋白指標，評估HJD和抑苦掩味伴侶劑對小鼠胰腺、腎臟和肝臟功能的影響。

試驗期間，每天觀察小鼠行為活動3次，各實驗組小鼠均無死亡，活動正常，行為活躍，無躁動、過度興奮、精神萎靡和步態(tài)異常或者腺體分泌異常等情況，毛發(fā)整潔有光澤、無毛發(fā)脫落現(xiàn)象，糞便的顏色、形狀和硬度均正常。據(jù)健康小鼠血液生化指標[16]判定急性毒性試驗中的小鼠器官損害情況，結果見表3。各組的白蛋白、尿酸氮、肌酐、血糖均在正常值范圍內(nèi)：白蛋白（28.70±3.00）g/L、尿酸氮（3.46±0.98）mmol/L、肌酐（74.27±16.80）μmol/L、血糖（5.12±0.06）mmol/L，HJD和抑苦掩味伴侶劑對小鼠的胰腺、腎臟和肝臟等器官功能無明顯損害。

表3 伴侶劑對HJD急性毒性的影響 ( , n = 10)Table 3 Effect of companion on acute toxicity of HJD ( , n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 白蛋白/(g·L?1) 尿素氮/(mmol·L?1) 肌酐/(μmol·L?1) 血糖/(mmol·L?1)對照 ? 28.44±3.06 3.70±0.91 83.41±12.27 5.21±0.56 HJD 37.5 29.44±2.74 3.68±0.75 74.39±9.01 5.13±0.05 25.0 29.99±0.81 3.53±0.69 87.74±10.28 5.13±0.17 HJD+伴侶劑 37.5 28.28±2.11 3.82±0.23 89.70±5.72 5.36±0.28 25.0 30.00±2.66 3.97±0.41 72.71±8.35 5.34±0.19

2.6 16S rDNA測序分析伴侶劑和HJD對小鼠腸道菌群的影響

2.6.1 標本收集 清潔級昆明小鼠，隨機分為對照組、雙抗組（鏈霉素1 g/kg+青霉素1 g/kg），HJD組（4.5 g/kg）與HJD+伴侶劑組（4.5 g/kg）。ig給藥，每天1次，連續(xù)14 d。無菌條件下取小鼠糞便，?80 ℃保存，干冰送樣，進行16S rDNA Amplicon測序。

2.6.2 測序 樣品經(jīng)抽提基因組的DNA并質(zhì)檢，設計、合成16S rDNA擴增的V3-V4通用引物區(qū)的特異性引物［341 F：forward primer（5’-3’）：CCTA CGGGRSGCAGCAG和806 R：reverse primer（5’-3’）：GGACTACVVGGGTATCTAATC］，擴增PCR、純化產(chǎn)物并進行文庫質(zhì)檢，對質(zhì)檢合格的文庫進行Qubit定量，最后使用Illumina Miseq PE250進行測序。測序結果按照以下流程進行生物信息分析。對原始數(shù)據(jù)執(zhí)行質(zhì)量控制（quailty control，QC）后，采用Usearch v11軟件對合格的數(shù)據(jù)進行去嵌合體和聚類分析。得到物種豐度表，以進行后續(xù)組間和組內(nèi)物種多樣性、物種線性判別（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析。

2.6.3 伴侶劑和HJD對小鼠腸道菌群多樣性的影響 α多樣性分析辛普森指數(shù)，結果表明，與對照組、HJD組、HJD+伴侶劑組相比，雙抗組有所升高，但無顯著性差異（圖2-A）。香農(nóng)指數(shù)結果表明，與對照組、HJD組和HJD+伴侶劑組相比，雙抗組指數(shù)顯著下降（P＜0.001，圖2-B）。同時，Anosim相似性分析結果表明，組間差異顯著大于組內(nèi)差異（圖2-C），即雙抗顯著降低了小鼠的腸道菌群多樣性，而HJD對菌群多樣性的影響不顯著，抑苦掩味后菌群多樣性與HJD組、對照組差異亦不顯著。

圖2 伴侶劑和HJD對小鼠腸道菌群多樣性的影響 ( ,n = 6)Fig.2 Effects of companion and HJD on intestinal flora diversity in mice ( , n = 6)

2.6.4 伴侶劑和HJD對小鼠腸道菌群豐度的影響在門水平上，各樣本中豐度最高菌為擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）（表4）。且厚壁菌門/擬桿菌門比值（F to B ratio）和變形菌門/擬桿菌門比值（P to B ratio）無顯著性差異。

表4 伴侶劑和HJD對小鼠腸道菌群豐度的影響 ( , n = 6)Table 4 Effect of companion and HJD on intestinal flora abundance in mice ( , n = 6)

表4 伴侶劑和HJD對小鼠腸道菌群豐度的影響 ( , n = 6)Table 4 Effect of companion and HJD on intestinal flora abundance in mice ( , n = 6)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與HJD組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與HJD+伴侶劑組比較：△△P＜0.01 △△△P＜0.001*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 ***P＜0.001 vs blank group; #P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 ###P ＜ 0.001 vs HJD group; △△P ＜ 0.01 △△△P ＜ 0.001 vs HJD + taste-suppressing companion group

組別 劑量/(g·kg?1)門水平主要菌組成變化/%擬桿菌門 變形菌門 厚壁菌門 厚壁菌門/擬桿菌門比值 變形菌門/擬桿菌門比值對照 ? 56.07±1.78 2.62±2.02 39.13±2.29 0.75±0.18 0.05±0.01 HJD 4.5 67.80±1.50 2.89±1.15 29.28±3.85 0.47±0.11 0.04±0.02 HJD+伴侶劑 4.5 59.23±2.70 1.81±0.82 38.68±4.33 0.84±0.24 0.03±0.01雙抗 1+1 39.42±5.40 53.63±4.01 6.94±3.04 0.45±0.42 4.38±6.46組別 劑量/(g·kg?1)屬水平主要差異菌群相對豐度統(tǒng)計/%Escherichia/Shigella Bacteroides Alistipes Clostridium XlVa Helicobacter Clostridium sensu stricto Oscillibacter對照 ? 0.03±0.01 6.27±0.77 4.77±0.79 1.51±0.42 1.48±0.33 0.00±0.00 1.09±0.23 HJD 4.5 1.29±0.42 22.57±6.53* 1.20±0.45* 1.47±0.73 1.41±0.58 0.04±0.03 0.78±0.45 HJD+伴侶劑 4.5 0.41±0.11 5.50±1.48# 0.00±0.00* 3.04±0.85 1.59±0.78 0.00±0.00 0.87±0.24雙抗 1+1 55.23±7.32***###△△△ 16.27±4.77 1.26±0.56* 0.01±0.00**##△△ 0.00±0.00*# 0.00±0.00 0.00±0.00**#

在屬水平檢測對照組與雙抗組、HJD組，對照組與HJD組、HJD+伴侶劑組的菌群結構。與雙抗組相比，對照組和HJD組埃希菌（Escherichia/Shigella）的相對豐度顯著降低（P＜0.001），另枝菌屬（Alistipes）、梭菌XIVa（Clostridium XlVa）、螺桿菌屬（Helicobacter）、厭氧芽孢桿菌（Clostridiumsensu stricto）相對豐度顯著升高（P＜0.05）；與HJD組相比，HJD+伴侶劑組的Bacteroides顯著降低（P＜0.05），其他菌屬變化不顯著。

應用LEfSe分析軟件判別伴侶劑對HJD多級物種差異的影響，結果表明，抑苦掩味伴侶劑對HJD給藥干預1周的小鼠腸道菌群影響不顯著。從門水平到屬水平，在LEfSe層級樹中標注共同差異基因（圖3），抑苦掩味伴侶劑組目水平優(yōu)勢菌種為脫硫弧菌（Desulfovibrionales）。

圖3 LEfSe多級物種層級樹圖Fig.3 LEfSe multilevel species hierarchy tree

3 討論

抑苦掩味伴侶劑能有效改善[13]中藥湯劑如HJD的口感，其應用有利于提高中醫(yī)臨床患者服藥順應性。然而，作為輔料，在抑苦掩味的同時，必須以不影響藥物療效、安全性和主要有效成分的含量測定為前提。本課題組前期研究表明，抑苦掩味伴侶劑不影響HJD的指紋圖譜和主要有效成分的含量測定。本研究表明，伴侶劑未顯著影響HJD體外抗氧化、抗耳腫脹、解熱、急性毒性和對腸道菌群的作用。LPS、干酵母和2,4-二硝基酚（DNP）等是發(fā)熱模型常用致熱原[17]。其中，LPS致熱模型為最經(jīng)典的炎性發(fā)熱模型。研究發(fā)現(xiàn)，HJD對LPS致小鼠高熱模型具有良好的解熱作用。在ip內(nèi)毒素60 min后，模型組小鼠肛溫逐漸下降，甚至低于基礎體溫，這可能是機體自我保護作用的結果。

腸道菌群的物種多樣性和豐富度是反映腸道菌群組成的重要指標[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，青霉素與鏈霉素合用（雙抗）顯著降低了小鼠腸道菌群的種類和豐度，而HJD及其抑苦掩味伴侶劑對其影響不顯著。小鼠腸道菌群90%由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門組成，厚壁菌門/擬桿菌門比值和變形菌門/擬桿菌門比值可有效反應腸道菌群的紊亂情況[19]。本研究表明，雙抗、HJD及其伴侶劑對厚壁菌門/擬桿菌門比值和變形菌門/擬桿菌門比值影響不顯著。

擬桿菌屬Bacteroides是腸道菌群的主要組成，參與機體多糖、膽汁酸和類固醇代謝、碳水化合物發(fā)酵以及維持腸道正常生理等多種功能[20]，為宿主提供能源[21]。與HJD組樣品相比，伴侶劑顯著降低了小鼠腸道中擬桿菌的豐度（P＜0.05）。脫硫弧菌（Desulfovibrionales）是一種硫酸鹽還原厭氧菌，廣泛存在于各種環(huán)境中，很少引起人類感染[22]。與HJD組樣品相比，它是伴侶劑組中的優(yōu)勢菌屬。綜上，抑苦掩味伴侶劑不影響HJD的藥效（抗炎、抗氧化和解熱）、毒性和對腸道菌群的作用，安全有效。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突