崔文超，劉明遠(yuǎn)，關(guān)寶生，曾 佳，田亞妮，鄧仲修，白 雪*

1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007

2.佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007

肝癌是世界上最常見的癌癥之一，其死亡原因大多以轉(zhuǎn)移為主[1]。肝癌的主要危險因素是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染，且由于肝癌復(fù)發(fā)率較高，患者的生存率普遍很低[2-3]。因此，探尋一種針對肝癌行之有效的治療藥物至關(guān)重要。常春藤皂苷元（hederagenin，HD）最初主要從五加科常春藤屬植物中華常春藤Hedera nepalensisK.Koch var.sinensis(Tobl.) Rehd.中提取出來。研究顯示，HD在體外和體內(nèi)具有抗癌[4]、抗炎[5]和抗動脈硬化[6]的活性。本課題組多年來一直致力于HD的抗肝癌作用研究，前期研究顯示，HD通過線粒體途徑和死亡受體途徑在體內(nèi)發(fā)揮抗肝癌作用[7]。因此，在前期工作基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，進(jìn)一步分析常春藤皂苷元抗肝癌的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞庫。

1.2 藥品與試劑

HD（批號465-99-6，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%）購自成都瑞芬思生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號2203194）購自美國Gibco公司；胰蛋白酶（批號C0201-100 mL）、Western及IP細(xì)胞裂解液（批號P0013）和RIPA強(qiáng)裂解液（批號P0013B）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（批號20120703）購自浙江天杭生物科技股份有限公司；PVDF膜（批號46273700）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；BCA試劑盒（批號MA0082-2-Aug-20G）、ECL發(fā)光液（批號MA0186-Apr-29G）、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性試劑盒（批號MB4698-1）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）抗體（批號WL02841）、細(xì)胞分裂周期蛋白 25A（cell division cycle 25A，CDC25A）抗體（批號WL04650）、CDC25B抗體（批號WL02958）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）抗體（批號WL00940）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）抗體（批號WL01750）、雄性激素受體（androgen receptor，AR）抗體（批號WL00223）購自萬類生物科技有限公司；β-actin抗體（批號AC-15）、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號BA1039）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 儀器

全自動多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司），電泳儀（德國Biometra公司）；激光近紅外成像儀（美國Azure Biosystems公司）；5804R型多功能離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）。

2 方法

2.1 生物信息學(xué)分析

2.1.1 鑒定HD/肝癌交集基因 通過UCSC Xena網(wǎng)站獲取肝癌患者的高通量RNA-seq數(shù)據(jù)，基因表達(dá)譜通過歸一化和基于log2轉(zhuǎn)化進(jìn)行定量。之后，通過R軟件中的“Limma”包對肝癌高通量RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因篩選。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：log2轉(zhuǎn)換倍數(shù)變化（FC）的絕對值≥1且校正后的P值（Padj）＜0.05。通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索HD作用靶點(diǎn)，對肝癌差異基因和HD作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對，以獲得二者的交集基因。最后使用Uniprot數(shù)據(jù)庫中的審查（Swiss-Prot）確定最終候選的交集基因。

2.1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）的構(gòu)建及其核心基因分析 使用String數(shù)據(jù)庫下載HD/肝癌交集基因的PPI數(shù)據(jù)，后將數(shù)據(jù)以txt文檔格式輸入Cytoscape_3.9.0軟件中，使用Cytoscape_3.9.0軟件中的Cytohubba插件根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值大小篩選前8個核心基因。

2.1.3 分子對接 通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取HD的分子結(jié)構(gòu)，PDB數(shù)據(jù)庫獲取IL-6、CDC25A和PTGS2蛋白的3D結(jié)構(gòu)，使用ChemBioOffice軟件中的ChemBio3D繪圖模塊對HD藥物結(jié)構(gòu)進(jìn)行力場優(yōu)化，使用Autodock Vina軟件的輔助工具M(jìn)GLTools 1.5.6對IL-6、CDC25A和PTGS2蛋白進(jìn)行處理和氫化，將原始的蛋白pdb文件格式轉(zhuǎn)換為Autodock Vina程序認(rèn)可的pdbqt格式。此外，通過Autodock Vina軟件中的網(wǎng)格盒功能，在合理設(shè)置對接參數(shù)的情況下，根據(jù)均方根差（root-mean-square deviation，RMSD）篩選最佳HD結(jié)合位點(diǎn)。Pymol軟件繪制HD與IL-6、CDC25A和PTGS2蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 HD對HepG2細(xì)胞增殖的影響 將HepG2細(xì)胞以5000個/孔接種至96孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別給予30、60、120 μg/mL的HD處理HepG2細(xì)胞24、48 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），于37 ℃繼續(xù)孵育4 h；加入150 μL二甲基亞砜終止孵育，使用酶標(biāo)儀測定各孔在570 nm處的吸光度（A）值。

2.2.2 HD對HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響 在6孔板內(nèi)放入細(xì)胞爬片，將HepG2細(xì)胞以5×105個/mL接種至6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上，分別給予30、60、120 μg/mL的HD處理24 h，干預(yù)24 h后取出爬片，固定后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.2.3 Western blotting法檢測CDC25A、CDC25B、IL6、AR、ESR1和PTGS2蛋白表達(dá)

（1）HD對HepG2細(xì)胞CDC25A、CDC25B、IL-6、AR、ESR1和PTGS2蛋白表達(dá)的影響 收集HD干預(yù)24 h后HepG2細(xì)胞，加入Western及IP細(xì)胞裂解液提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉后，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，37 ℃孵育1.5 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，采用Image J軟件進(jìn)行分析。

（2）HD對H22荷瘤小鼠瘤體組織CDC25A、CDC25B、IL-6、AR、ESR1和PTGS2蛋白表達(dá)的影響 取本課題組前期研究[7]中對照組、環(huán)磷酰胺（25 mg/kg）組和HD（100、200、400 mg/kg）組的H22荷瘤小鼠瘤體組織，剪碎后加入RIPA強(qiáng)裂解液提取總蛋白。采用Western blotting法檢測瘤體組織CDC25A、CDC25B、IL-6、AR、ESR1和PTGS2蛋白表達(dá)情況。

2.3 統(tǒng)計分析

采用R軟件和GraphPad Prism 8.0軟件（GraphPad Software Inc）進(jìn)行繪圖和分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，兩組獨(dú)立樣本采用t檢驗(yàn)分析，多組樣本采用One-away ANOVA分析。

3 結(jié)果

3.1 生物信息學(xué)分析

3.1.1 HD/肝癌交集基因的鑒定 如圖1-A所示，通過R軟件“Limma”包篩選得到了6962個肝癌相關(guān)的差異基因。如圖 1-B 所示，經(jīng)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中預(yù)測發(fā)現(xiàn)75個HD的潛在作用靶點(diǎn)。如圖1-C所示，對2個基因集進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了29個HD/肝癌交集基因。

圖1 HD/肝癌交集基因的鑒定Fig.1 Identification of HD/hepatocellular carcinoma crossover genes

3.1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因分析 如圖2-A所示，使用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了HD/肝癌交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。如圖2-B所示，通過使用Cytoscape_3.9.0軟件中的Cytohubba插件篩選了PPI網(wǎng)絡(luò)中前8個核心基因，分別為AR、ESR1、PTGS2、IL-6、孕酮受體（progesterone receptor，PGR）、性激素結(jié)合球蛋白（sex hormone-binding globulin，SHBG）、細(xì)胞色素P450酶17A1（cytochrome p450 family 17A1，CYP17A1）和CYP19A1。

圖2 HD/肝癌交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖中核心基因的鑒定Fig.2 Identification of core genes in PPI network of HD/hepatocellular carcinoma crossover genes

3.1.3 分子對接 采用分子對接預(yù)測了HD與IL-6、CDC25A和PTGS2蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。如圖3所示，HD分別與IL-6蛋白上65號位的LYS氨基酸殘基、CDC25A蛋白379號位PHE氨基酸殘基、PTGS2蛋白34號與133號ASN和ASP氨基酸殘基形成氫鍵。

圖3 HD與IL-6 (A)、CDC25A (B) 和PTGS2 (C) 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)Fig.3 Binding sites of HD with IL-6 (A), CDC25A (B) and PTGS2 (C) proteins

3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 HD對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用 本課題組前期通過Hoechst 33342熒光單染、AO/EB熒光雙染和Annexin V-FITC染色已證實(shí)HD誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡[7]。本研究通過使用MTT法檢測不同質(zhì)量濃度（30、60、120 μg/mL）HD干預(yù)后HepG2細(xì)胞的增殖情況，如圖4-A所示，與對照組（0 μg/mL）相比，各給藥組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05、0.01），且呈劑量和時間相關(guān)性。使用HE染色法檢測不同質(zhì)量濃度（30、60、120 μg/mL）HD干預(yù)后HepG2細(xì)胞的形態(tài)變化，如圖4-B所示，與對照組相比，HD組細(xì)胞密度呈降低趨勢，細(xì)胞膜與核膜出現(xiàn)皺縮。

圖4 HD對HepG2細(xì)胞增殖 (A) 和細(xì)胞形態(tài) (B) 的影響 (HE, ×200)Fig.4 Effect of HD on proliferation (A) and morphology of HepG2 cells (HE, × 200)

3.2.2 HD對HepG2細(xì)胞IL-6、CDC25A、PTGS2、AR、CDC25B和ESR1蛋白表達(dá)的影響 通過對HD/肝癌交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，確定IL-6、AR、ESR1和PTGS2為核心靶點(diǎn)。同時，細(xì)胞周期調(diào)控因子CDC25A和CDC25B在HD/肝癌交集基因中，考慮到它們的重要性，本研究將其納入分析，推測HD可能通過作用于IL-6、CDC25A、PTGS2、AR、CDC25B和ESR1，從而發(fā)揮抗肝癌的作用。為了證實(shí)分析的正確性，通過體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，應(yīng)用Western blotting法檢測HD（30、60、120 μg/mL）干預(yù)后HepG2細(xì)胞內(nèi)IL-6、CDC25A、PTGS2、AR、CDC25B和ESR1蛋白表達(dá)情況。如圖5所示，與對照組比較，各給藥組HepG2細(xì)胞IL-6、CDC25A、ESR1和PTGS2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），HD（30、60 μg/mL）組AR蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），HD（60 μg/mL）組CDC25B蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

圖5 HD對HepG2細(xì)胞IL-6、CDC25A、PTGS2、AR、CDC25B和ESR1蛋白表達(dá)的影響 ( , n = 3)Fig.5 Effect of HD on expressions of IL-6, CDC25A, PTGS2, AR, CDC25B and ESR1 proteins in HepG2 cells (, n = 3)

3.2.3 HD對H22荷瘤小鼠瘤體IL-6、CDC25A、PTGS2、AR、CDC25B和ESR1蛋白表達(dá)的影響 本課題組前期通過構(gòu)建H22荷瘤小鼠模型，應(yīng)用HE染色分析了HD對H22荷瘤小鼠肝臟和腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果表明，HD對小鼠肝臟和腎臟無明顯毒副作用。此外，本課題組還分析了HD對H22荷瘤小鼠腫瘤組織的形態(tài)學(xué)影響，結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)HD治療的小鼠腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊中央出現(xiàn)大面積壞死灶，伴有炎性細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞數(shù)明顯減少，同時部分腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了核固縮、破裂和溶解的現(xiàn)象[7]。因此，本研究將對照組、HD組和環(huán)磷酰胺組的H22荷瘤小鼠瘤體組織納入分析，采用Western blotting檢測各組H22荷瘤小鼠瘤體中IL-6、CDC25A、PTGS2、AR、CDC25B和ESR1蛋白表達(dá)。如圖6所示，與對照組相比，各給藥組IL-6、CDC25A、PTGS2、CDC25B和ESR1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），HD（200、400 mg/kg）組和環(huán)磷酰胺組AR蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

圖6 HD對H22荷瘤小鼠瘤體IL6、CDC25A、PTGS2、AR、CDC25B和ESR1蛋白表達(dá)的影響 ( , n = 3)Fig.6 Effect of HD on expressions of IL-6, CDC25A, PTGS2, AR, CDC25B and ESR1 proteins in tumor of H22 tumor-bearing mice ( , n = 3)

4 討論

全世界每年大約有84萬肝癌新發(fā)病例、78萬人死于肝癌，患者5年平均生存率不到10%[8]。手術(shù)切除、肝移植、局部應(yīng)用放療以及綜合治療是肝癌的主要治療方案[9]。但由于肝癌發(fā)病的隱匿性和缺乏特異的早期標(biāo)志物，導(dǎo)致大多數(shù)患者往往被診斷為肝癌晚期，不適合手術(shù)治療，生存時間一般只有6個月[10]。由此可見，迫切需要開發(fā)一種靶向性強(qiáng)的、毒性小和不良反應(yīng)少的抗肝癌藥物以提高肝癌患者生存率。在前期研究中，本課題組通過體內(nèi)和體外2個途徑證明HD具有明顯的抗肝癌作用，但具體機(jī)制尚不明確。因此，在前期工作基礎(chǔ)上，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，進(jìn)一步揭示HD抗肝癌的作用機(jī)制。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)手段，通過對HD/肝癌交集基因進(jìn)行PPI分析，發(fā)現(xiàn)CDC25A、IL-6和PTGS2為HD潛在靶點(diǎn)。CDC25A是一種雙特異性蛋白磷酸酶，是最關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑之一，能夠清除周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）如CDK2、CDK4和CDK6等的抑制性磷酸化，并對CDKs的活性進(jìn)行正向調(diào)節(jié)，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)展[11]。CDC25A在腫瘤細(xì)胞的周期、凋亡、代謝和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[12-14]。過表達(dá)的CDC25A與腫瘤相關(guān)因子[如核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、中心體相關(guān)激酶2（NIMA related kinase 2，NEK2）、丙酮酸激酶M1（pyruvate kinase isozymes M1，PKM1）和叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1（Forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）]相互作用，共同促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展[15-17]。此外，CDC25A在肝癌中高表達(dá)，與肝癌患者門靜脈血栓形成、肝外轉(zhuǎn)移和肝癌分化程度等臨床病理參數(shù)呈正相關(guān)[18]。IL-6是典型的促腫瘤細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)STAT3介導(dǎo)的多種致癌過程[19-21]。IL-6能夠增強(qiáng)與細(xì)胞周期和細(xì)胞生存相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，如G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin-D1，Cyclin D1）、原癌基因MYC、細(xì)胞凋亡抑制劑survivin（baculoviral IAP repeat containing 5，BIRC5）[22-24]。此外，IL-6還可促進(jìn)與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，如低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia iducible factor-1α，HIF-1α）、基質(zhì)金屬蛋白酶2/7/9（matrix metalloproteinase 2/7/9，MMP2/7/9）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[25]。研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞具有以下功能：生長信號自給自足、對生長抑制信號不敏感、逃避細(xì)胞程序性死亡、無限復(fù)制潛力、持續(xù)血管生成以及組織侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。事實(shí)上，抑制PTGS2蛋白的表達(dá)已被證明干擾了這些功能中的大部分，這為治療多種惡性腫瘤提供了一種很有前途的方法[27-29]。此外，在絕大多數(shù)關(guān)于PTGS2抑制劑對肝癌細(xì)胞影響的體外研究中，發(fā)現(xiàn)使用PTGS2抑制劑處理后，肝癌細(xì)胞存活率均顯著降低[30-33]。因此，考慮到CDC25A、IL-6和PTGS2在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的重要性，推測HD可能主要通過作用于CDC25A、IL-6和PTGS2，從而起到抗肝癌的作用。從分子生物學(xué)角度，本研究通過體內(nèi)外途徑檢測了HD對CDC25A、IL-6和PTGS2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，HD組CDC25A、IL-6和PTGS2蛋白表達(dá)水平均顯著降低。提示HD可能通過調(diào)控CDC25A蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的增殖周期；通過調(diào)控IL-6蛋白表達(dá)水平，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低；調(diào)控PTGS2蛋白表達(dá)水平，從而影響肝癌細(xì)胞的程序性死亡，最終導(dǎo)致肝癌細(xì)胞的增殖受到抑制。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)HD可能主要通過作用于CDC25A、IL-6和PTGS2，從而起到抗肝癌的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突