田宗旺 李 想 劉彥威

（河北工程大學(xué)，河北邯鄲 056107）

冬蟲夏草自古以來就是我國傳統(tǒng)名貴中藥，與人參、鹿茸并稱為“中藥三寶”，實(shí)則為中國被毛孢真菌。硒（Selenium，Se）是元素周期表第34號元素，是一種非金屬元素，性質(zhì)介于硫元素和碲元素之間，最初被視為對人體有害的元素。我國直到20世紀(jì)60年代對克山病的防治研究才發(fā)現(xiàn)硒對人體有益，是人體不可缺少的微量元素[1]。硒還是抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶、代謝酶硫氧還蛋白還原酶、甲狀腺激素激活酶和碘甲狀腺原氨酸5?去碘酶等多種酶的重要組成部分[2?4]。目前富硒方式主要靠植物、動(dòng)物、微生物或人工合成。區(qū)別于動(dòng)物和植物富硒，微生物富硒具有生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，受環(huán)境影響小，操作簡單，硒含量和硒轉(zhuǎn)化率高，成本低廉等諸多優(yōu)勢。

筆者通過添加外源硒（Na2SeO3）培養(yǎng)冬蟲夏草耳型菌核，探究冬蟲夏草生長過程中富硒情況以及最終的硒形態(tài)，旨在為更全面地評價(jià)冬蟲夏草耳型菌核富硒水平，并為富硒食品開發(fā)和其他相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試主要材料

冬蟲夏草菌株（邯鄲市禽病預(yù)防控制中心分離鑒定）；在淺層靜止培養(yǎng)法[5?6]的基礎(chǔ)上，配制質(zhì)量濃度為10 g/L的亞硒酸鈉（Na2SeO3）溶液，分別添加0μL、600μL、900μL、1 200μL、1 500μL、1 800μL、2 100μL、2 400μL、3 000μL、4 500μL和6 000μL于培養(yǎng)基中，對應(yīng)培養(yǎng)基中的Na2SeO3質(zhì)量濃度為0 mg/L，4 mg/L，6 mg/L，8 mg/L，10 mg/L，12 mg/L，14 mg/L，16 mg/L，20 mg/L，30 mg/L，40 mg/L。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。將培養(yǎng)基置蒸汽滅菌柜中121℃滅菌30 min。待完全冷卻至室溫后按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%接種量接種試驗(yàn)菌種。18℃靜止培養(yǎng)5個(gè)月20 d。得到的冬蟲夏草耳型菌核經(jīng)真空冷凍干燥，超微粉碎后作為試驗(yàn)樣品。

1.2 供試主要試劑

消解所用化學(xué)試劑均為優(yōu)級純，購于國藥集團(tuán)。Tris/HCl，鏈霉蛋白酶E購于北京索萊寶科技有限公司。硒標(biāo)準(zhǔn)品購于sigma。除另有注明，所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。

1.3 儀器和設(shè)備

原子熒光光譜儀（配硒空心陰極燈）Kylin S18（北京吉天儀器有限公司）；天平BSA124S（德國Sartorius公司）；電熱板DRB4 030 A（冠森生物科技有限公司），MARS6微波消解儀（美國CEM公司）配聚四氟乙烯消解內(nèi)罐；Flexar Binary液相色譜儀（美國PerkinElmer公司）；NexIon 300DICP?MS（美國PerkinElmer公司）；高速離心機(jī)400R（美國Thermo公司）

1.4 硒含量標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

參照GB 5009.93-2017[7]做標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 硒含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 試樣消解

總硒含量測定消化方法參照GB 5009.93—2017[7]，無機(jī)硒含量測定消化方法參照GB 1903.22-2016[8]微波消解步驟。

硒形態(tài)測定消化采取酶解法：稱取約0.05 g的樣品于聚四氟乙烯管中，加入10 mL 50 mol/L的Tris/HCl緩沖液和10 mg鏈霉蛋白酶E。旋渦振蕩器混合均勻后，將聚四氟乙烯管放入微波消解器。萃取程序如下：先用時(shí)10 min上升至40℃，保持60 min，微波功率為160 W，然后再用時(shí)5 min上升至45℃，保持20 min，微波功率為200 W。微波萃取結(jié)束后，將樣品倒入15 mL塑料離心管，以8 000 r/min離心3 min，過0.45μm濾膜，上機(jī)備用。

1.6 硒含量分析參數(shù)

儀器參數(shù)：總燈電流70 mA，輔陰極燈電流35 mA，光電倍增管負(fù)高壓270 V，原子化高度8 mm，載氣流量300 mL/min，屏蔽氣流量800 mL/min。

進(jìn)樣泵參數(shù)：步驟一，時(shí)間0 s，A泵轉(zhuǎn)速1 500 r/min，B泵轉(zhuǎn)速0 r/min；步驟二，時(shí)間27 s，A泵轉(zhuǎn)速100 r/min，B泵轉(zhuǎn)速120 r/min。

測量條件：測量方式為標(biāo)準(zhǔn)曲線法，讀數(shù)方式為峰面積，延遲時(shí)間1 s，讀數(shù)時(shí)間15 s，加液時(shí)間8 s，進(jìn)樣體積2 mL。

硒含量計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[7]。

富硒率=有機(jī)硒含量（μg/g）×平均干燥質(zhì)量（g）/外源硒添加量（μg）×100%

1.7 硒形態(tài)分析參數(shù)

HPLC條件：Hamilton PRP?X100陰離子交換柱（250 mm×4.1 mm，10μm），流動(dòng)相為5 mmol/L檸檬酸溶液（pH 4.7，10%氨水調(diào)節(jié)），流速1.5 mL/min，進(jìn)樣量50μL。

ICP?MS條件：RF功率1 300 W，等離子氣（Ar）流速15 L/min，反應(yīng)氣（CH4）流速0.8 mL/min，Rpq值0.6，霧化氣流速1.0 L/min。采集80Se同位素?cái)?shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬蟲夏草耳型菌核培養(yǎng)結(jié)果及富硒情況

培養(yǎng)的冬蟲夏草耳型菌核干燥后質(zhì)量如表1。測得硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y=56.547X+0.567，R2為0.999，表明線性關(guān)系良好。將各樣品測得的熒光強(qiáng)度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出總硒和無機(jī)硒含量（表2）。

表1 冬蟲夏草耳型菌核干燥后質(zhì)量

表2 冬蟲夏草耳型菌核富硒情況

由表2可以看出，外源硒添加的質(zhì)量濃度在4~16 mg/L，隨著質(zhì)量濃度的遞增，耳型菌核中的總硒含量隨之遞增。添加的質(zhì)量濃度為16 mg/L時(shí)，耳型菌核富硒率最大，為23.326 6%，無機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.046 8 mg/kg。外源硒質(zhì)量濃度越高，冬蟲夏草耳型菌核中有機(jī)硒富硒率越高，但當(dāng)外源硒質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，富硒率下降至17.813 9%，表明外源硒添加的質(zhì)量濃度大于20 mg/L會(huì)抑制冬蟲夏草菌對硒的富集。國標(biāo)GB 1903.22—2016規(guī)定富硒食用菌粉，總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18~400 mg/kg，因此，對照表2可知，外源硒添加的最佳質(zhì)量濃度為10 mg/L，該質(zhì)量濃度下，耳型菌核的有機(jī)硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)和富硒率相對較高。由于硒添加30 mg/L和40 mg/L嚴(yán)重抑制其生物量，未納入表2統(tǒng)計(jì)。

圖2 硒標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖

2.2 硒形態(tài)測定分析

根據(jù)圖3看出，樣品中一共含有7種形態(tài)硒，1.394 4 min，1.528 8 min，1.747 2 min，2.536 8 min，3.427 2 min，4.720 8 min，5.560 8 min處出現(xiàn)峰值，對比硒標(biāo)準(zhǔn)品峰圖可以確定樣品中對應(yīng)的硒形態(tài)分別為硒代胱氨酸、未知硒形態(tài)、甲基硒代半胱氨酸、四價(jià)硒、硒代蛋氨酸、未知硒形態(tài)、六價(jià)硒。其中有機(jī)硒標(biāo)準(zhǔn)品中硒代乙硫氨酸出峰時(shí)間在12 min左右，而樣品在12 min沒有峰，說明冬蟲夏草耳型菌核中沒有硒代乙硫氨酸。

圖3 樣品離子色譜圖

利用單點(diǎn)校準(zhǔn)公式作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過峰面積代入公式即可計(jì)算原始質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再通過稱樣量和定容體積可以計(jì)算最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)。由表3可以看出，有機(jī)硒中硒代胱氨酸，甲基硒代半胱氨酸，硒代蛋氨酸最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，有機(jī)化程度高，四價(jià)硒和六價(jià)硒最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，與國標(biāo)方法原子熒光光譜測總硒和無機(jī)硒的結(jié)果一致。通過酶解提取到的蛋白態(tài)和無機(jī)態(tài)有損失，另外還有一些未知蛋白態(tài)以及一些硒糖類。

表3 冬蟲夏草耳型菌核硒形態(tài)

樣品離子色譜圖與DENG等[9]譜圖樣品出峰順序一致，出峰時(shí)間也大致相同，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[10?11]推測1.528 8 min和4.720 8 min時(shí)間出峰樣品分別為硒代半胱氨酸和N?乙酰?硒代蛋氨酸。

3 小結(jié)與討論

微生物富硒是在代謝過程中將無機(jī)硒插入到蛋白質(zhì)的二硫鍵而引起結(jié)構(gòu)弱點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)從無機(jī)硒到有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化。JI等[12]發(fā)現(xiàn)硒質(zhì)量濃度會(huì)影響菌絲生物量，與無添加硒培養(yǎng)基比較，低質(zhì)量濃度的硒顯著促進(jìn)菌絲的生長。ZHANG等[13]設(shè)置20～80 mg/L四個(gè)梯度質(zhì)量濃度深層發(fā)酵冬蟲夏草，采用原子吸收光譜法測得平均富硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為900μg/g，1 040μg/g，1 709μg/g，1 552μg/g。筆者發(fā)現(xiàn)在0~20 mg/L外源硒質(zhì)量濃度內(nèi)總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為631 mg/kg，當(dāng)外源硒質(zhì)量濃度在4~16 mg/L，冬蟲夏草富硒率維持在21%以上，但當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)富硒率降為17.812 9%。研究結(jié)果表明，添加硒不能促進(jìn)菌絲成長，可能是因?yàn)椴捎玫氖菧\層靜止的培養(yǎng)方法和人工復(fù)配的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式和檢測方法有別于前人研究，另外不同菌株的富硒水平也存在差異，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

BHATIA等[14]利用HPLC?ICP?MS方法檢測富硒雙孢蘑菇，模擬胃腸道提取硒，測得硒的形成以硒代蛋氨酸為主，占檢測物種總數(shù)的73%，以及一些其他被氧化的硒物種存在；另一方面，只有2%的樣品以硒（IV）形式存在于無機(jī)硒中；在胃腸消化過程中產(chǎn)生的其他一些低分子量硒化合物（占色譜硒含量的25%）仍未鑒定。研究中的富硒冬蟲夏草耳型菌核無機(jī)硒含量較低，作為富硒食品更安全，品質(zhì)也更高。

對于硒形態(tài)測量，NEHZATI等[15]利用高能熒光檢測X射線吸收光譜法測定硒形態(tài)，建立硒代氨基酸光譜圖，且克服了復(fù)雜混合物硒形態(tài)形成的一些缺陷，同時(shí)證明硒代氨基酸的光譜與它們的硫同屬物有很強(qiáng)的相似性，X射線吸收光譜也存在不能區(qū)分元素價(jià)態(tài)的缺點(diǎn)。筆者采用HPLC?IPC?MS法分析富硒冬蟲夏草耳型菌核硒形態(tài)，對比標(biāo)準(zhǔn)譜圖結(jié)果準(zhǔn)確，而兩種未知硒形態(tài)還需進(jìn)一步確定研究。