張 靜，曾敏珊，賴俊敏，李思源，嚴(yán)小紅，丁 怡

（廣州市藥品檢驗所，廣東 廣州 510160）

亞硝胺類化合物具有致癌或潛在致癌風(fēng)險［1］。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年）與歐盟化妝品法規(guī)（2009 年）均將亞硝胺類化合物列入禁用目錄，并規(guī)定化妝品原料中亞硝胺類雜質(zhì)不得超過50 μg/kg［2-3］。歐盟消費者安全科學(xué)委員會（Scientific Committee on Consumer Safety，SCCS）近年來陸續(xù)通報在化妝品中檢出超限的亞硝胺類化合物［4-5］。

亞硝胺通常痕量存在于化妝品中，對方法的靈敏度要求極高，因此選擇合適的檢測方法尤為重要。熱能分析儀對亞硝胺結(jié)構(gòu)具有檢測特異性，是檢測亞硝胺的專屬儀器［6］。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展，質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成為亞硝胺測定的主要方法。目前文獻報道的檢測方法多為液相色譜-質(zhì)譜法［7-9］和氣相色譜-質(zhì)譜法［10-12］，其中采用氣相色譜-質(zhì)譜法測定揮發(fā)性亞硝胺具有更高的靈敏度，成為最主要的檢測手段之一。但實際檢測過程中發(fā)現(xiàn)，氣相色譜-質(zhì)譜法測定化妝品中的亞硝胺存在以下不足：（1）專屬性不強，大多文獻［10-12］選擇響應(yīng)最高的離子作為監(jiān)測對象，但化妝品基質(zhì)復(fù)雜，干擾組分較多，某些化合物響應(yīng)最大的離子受到的干擾也最大，反而降低了方法的專屬性和靈敏度；（2）前處理繁瑣，耗時較長，易使揮發(fā)性亞硝胺損失，從而導(dǎo)致靈敏度下降。例如GB/T 29669-2013［10］中采取固相萃取后氮吹濃縮的方法，方法檢出限為1.25～5.0 mg/kg，不能滿足我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年）對亞硝胺類雜質(zhì)含量不得超過50 μg/kg 的限量要求；（3）前處理操作復(fù)雜，難以保證準(zhǔn)確度和精密度。Dong等［11］采用的液液萃取后氮吹濃縮的方法，需嚴(yán)格控制氮氣吹干程度，才能保證較好的精密度。

本研究旨在建立更加簡便準(zhǔn)確的化妝品中亞硝胺含量的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，著重解決以下問題：（1）針對化妝品的干擾特點，優(yōu)化氣相色譜、質(zhì)譜條件，提高專屬性；（2）優(yōu)化前處理條件，采用QuEChERS 前處理方法簡化操作，提高準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，以滿足我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年）中痕量分析的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890B 氣相色譜儀和7010B 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；渦旋混合儀（德國IKA 公司）；ST16R 離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；EMR-Lipid dSPE 增強型脂質(zhì)去除凈化管、EMRLipid Polish反萃管、陶瓷均質(zhì)子（美國Agilent公司）。

乙腈（色譜純，德國默克公司）；NaCl（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；實驗用水為一級水。

10 種亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液的質(zhì)量濃度為100 μg/mL 或1 000 μg/mL，購自曼哈格公司?；瘖y品樣品均為市售產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 氣相色譜條件色譜柱：聚乙二醇石英毛細管柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：40 ℃保持0.5 min，以15 ℃/min 升溫至190 ℃后，再以40 ℃/min 升溫至250 ℃，保持13 min；進樣口溫度：250 ℃；進樣體積：1.0 μL；不分流進樣；流速：1.0 mL/min；載氣：氦氣。

1.2.2 質(zhì)譜條件離子源：電子轟擊離子源（EI）電壓為-70 eV；傳輸線溫度：250 ℃；離子源溫度：250 ℃；碰撞氣：氬氣；測定方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。10種亞硝胺類化合物的保留時間、定性、定量離子和碰撞能等參數(shù)見表1。

表1 10種N-亞硝胺類化合物的分子式、CAS號、保留時間、母離子、子離子和碰撞能量Table 1 Formulas，CAS No.，retention times，parent ions，product ions and collision energies（CEs）of the 10 N-nitrosamines

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密量取10 種亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用乙腈稀釋定容制成10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃冰箱避光保存。取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，逐級稀釋制得質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于棕色進樣瓶中，備用。

1.4 供試品溶液的制備

稱取樣品1 g（精確至0.001 g）于15 mL 具塞離心管中，加入5 mL 乙腈，在渦旋混合儀上振蕩提取5 min，以8 000 r/min離心3 min，上清液待凈化。

向15 mL EMR-Lipid dSPE 增強型脂質(zhì)去除凈化管中加入5 mL水，渦旋混勻3 s活化。取全部上清提取液加入活化好的EMR-Lipid dSPE 增強型脂質(zhì)去除凈化管中，渦旋混合1 min，以8 000 r/min 離心3 min；取全部上清提取液加入15 mL EMR-Lipid Polish反萃管中，渦旋振蕩1 min，以8 000 r/min離心3 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

一般來說，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）的專屬性及靈敏度均優(yōu)于選擇離子監(jiān)測模式（SIM），故選擇MRM 模式進行檢測。文獻多采用響應(yīng)大的離子對作為監(jiān)測目標(biāo)，但是化妝品基質(zhì)復(fù)雜，干擾較多，響應(yīng)最大的離子對專屬性不一定最強。以N-亞硝基吡咯烷（NPYR）為例，文獻采用的監(jiān)測離子對多為m/z100→55 和m/z100→43，其響應(yīng)高，有利于提高靈敏度。但在實際樣品測定過程中發(fā)現(xiàn)，不同基質(zhì)的化妝品均對上述離子對有很強的干擾，反而造成專屬性及靈敏度下降。對10種亞硝胺進行一級掃描和二級掃描，篩選出響應(yīng)較強且不易受干擾的子離子對m/z100→70 和m/z100→68 作為監(jiān)測離子對，可兼顧專屬性及靈敏度的要求。

2.2 氣相色譜條件的優(yōu)化

亞硝胺化合物的極性不同，且差異較大。Dong等［11］考察了HP-INNOWAX、DB-5MS對化妝品中13 種亞硝胺的色譜行為，陳麗香等［13］考察了HP-INNOWAX、DB-1701、HP-5MS 對水產(chǎn)干制品中9 種亞硝胺的色譜行為，結(jié)果均表明HP-INNOWAX 對亞硝胺具有更好的峰形、分離度和重復(fù)性，尤其是對極性強、分子量最小的NDMA 有較好的保留，從而可排除基質(zhì)帶來的干擾。本實驗分別考察了10 種亞硝胺化合物在HP-INNOWAX（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）、VF-1301MS（30 m × 0.25 mm ×0.25 μm）上的色譜行為。結(jié)果表明，HP-INNOWAX 具有更尖銳的峰形和靈敏度，與文獻結(jié)果一致。因此選擇HP-INNOWAX 作為分析色譜柱。上述文獻均將50 ℃作為程序升溫的初始溫度，實際化妝品樣品測定過程中發(fā)現(xiàn)，該溫度下NDMA 保留時間附近有較大干擾峰，對定量造成影響，選擇40 ℃作為程序升溫的初始溫度可使分離度更好，提高定量的準(zhǔn)確度。通過優(yōu)化流速、升溫速率，10 種亞硝胺獲得較好的分離效果且靈敏度較高。圖1為10種亞硝胺的總離子流色譜圖。

圖1 10種N-亞硝胺類化合物（50 ng/mL）的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the 10 N-nitrosamines（50 ng/mL）

2.3 前處理方法優(yōu)化

化妝品基質(zhì)復(fù)雜，一般含有大量油脂性物質(zhì)和表面活性劑，且上述10 種亞硝胺的極性差異也較大。GB/T 29669-2013 采用不同溶劑對不同基質(zhì)的化妝品進行提取，經(jīng)固相萃取凈化后氮吹濃縮。Dong等［11］發(fā)現(xiàn)乙腈具有提取不同極性亞硝胺的能力，同時對化妝品中的油脂性物質(zhì)溶解性較小，是理想的提取溶劑。因此本文考察了乙腈直接提取法、鹽析輔助液液萃取法（水+乙腈+氯化鈉）、固相萃取法（采用HLB、Florisil、ENVI-Carb 3 種固相萃取小柱）的提取效果，結(jié)果表明鹽析輔助液液萃取法可獲得最佳提取效果，但該方法需通過氮吹濃縮達到靈敏度要求。而實際操作中，氮吹耗時較長，且易導(dǎo)致NDMA損失，影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。

QuEChERS 法是基于液液萃取和分散固相凈化提取的快速前處理技術(shù)，具有快速、簡便、低廉、有效、穩(wěn)定和安全的優(yōu)點，主要用于農(nóng)藥殘留檢測［14］。近年來QuEChERS 法的應(yīng)用范圍不斷增加，可測定更多種類的化合物［15-17］。增強型脂質(zhì)去除凈化管可有效去除非極性雜質(zhì)，提高結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度。本實驗采用QuEChERS 前處理方法，樣品經(jīng)乙腈提取后，采用EMR-Lipid dSPE 凈化管去除脂類等非極性雜質(zhì)，再經(jīng)EMR-Lipid Polish 反萃管除水，上清液直接過濾測定，避免了氮吹處理，提高了精密度。將本方法與已有文獻方法進行比較，發(fā)現(xiàn)在空白樣品中添加50 μg/kg 的亞硝胺時，GB/T 29669-2013 方法耗時最長，NDMA、NDEA、NPYR、NMorPh 的回收率低于80%，其中NDMA 的回收率僅30%（可能由于氮吹時間過長導(dǎo)致）；使用鹽析輔助液液萃取法［11］時多數(shù)亞硝胺的回收率與本方法接近，但精密度較差，且其中NDBzA 在香波類樣品中的回收率不足10%（可能與基質(zhì)有關(guān)）。故選用QuEChERS前處理方法可獲得更準(zhǔn)確靈敏的結(jié)果。

2.4 方法學(xué)確證

2.4.1 專屬性分別精密量取乙腈溶劑空白、對照品溶液（10 ng/mL）、空白樣品溶液、空白樣品加標(biāo)溶液，按照“1.2.1”和“1.2.2”條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示10種亞硝胺均無干擾，專屬性良好。

2.4.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限對“1.3”部分的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進行分析，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，10 種亞硝胺在0.5～50 ng/mL 范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 8～1.000 0。分別以定量離子信噪比（S/N）為3和10時的響應(yīng)為方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到LOD為1 μg/kg，LOQ為3 μg/kg。

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度取水、乳、膏霜、油、粉空白樣品，分別添加3 個水平（5、50、200 μg/kg）的10 種亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.4”方法進行處理，每個水平重復(fù)6 次，計算加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，10種亞硝胺的平均回收率為80.5%～143%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于11%（n=6），見表2。其中多數(shù)化合物的平均回收率在80.0%～120%之間，個別化合物回收率較高，可能是由基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致，稀釋供試品溶液或采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校正，可提高準(zhǔn)確度。

表2 化妝品中10種N-亞硝胺類化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations of the 10 N-nitrosamines in cosmetics（n=6）

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng)（ME）采用萃取空白樣品基質(zhì)后添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法考察基質(zhì)效應(yīng)：配制質(zhì)量濃度為10、40 ng/mL 的基質(zhì)溶液及相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同條件下進行分析，參考文獻［18］公式ME =（Pm/Ps-1）×100%計算ME。其中，Ps和Pm分別為標(biāo)準(zhǔn)溶液和含同濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基質(zhì)溶液中亞硝胺的響應(yīng)值。當(dāng)ME=0 時，表示沒有基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＜0 或ME＞0 時，分別表示基質(zhì)抑制或增強效應(yīng)。結(jié)果表明，ME 為-18.9%～24.0%（n=6），說明10 種亞硝胺在水、乳、膏霜、油、粉5 種不同基質(zhì)化妝品中表現(xiàn)出較為顯著的基質(zhì)效應(yīng)，這可能是個別化合物回收率偏高的原因。

2.5 實際樣品檢測

采用本方法對抽取的水、乳、膏霜、油、粉5 種不同基質(zhì)的37 批市售化妝品進行檢測。其中1 份沐浴露和1份洗發(fā)露樣品檢出NDPhA，含量分別為5.6、8.0 μg/kg，其他組分均未檢出。陽性樣品的MRM 提取離子色譜圖如圖2所示。

圖2 陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.2 Extraction ion chromatogram of a positive sample

3 結(jié) 論

本文采用QuEChERS前處理方法結(jié)合GC-MS/MS對化妝品中的10種亞硝胺進行定性定量分析。方法操作簡便、快速，專屬性強，靈敏度高，精密度、準(zhǔn)確度均較好，可應(yīng)用于水、乳、膏霜等不同化妝品基質(zhì)中10 種亞硝胺的測定，為化妝品中亞硝胺的風(fēng)險評估提供了技術(shù)支持。