蔡玉琦， 張佳鑫， 陳繼發(fā)

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，江西宜春336000）

腸道微生物能夠參與宿主養(yǎng)分消化吸收，調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝，維持機(jī)體免疫功能（Clavijo 等，2018；Horai 等，2017；Tremaroli 等，2012）。 微生物多樣性降低或菌群結(jié)構(gòu)失衡易導(dǎo)致宿主免疫機(jī)能下降、養(yǎng)分利用率降低、生長(zhǎng)或生產(chǎn)性能下降（Wu等，2021；Zhang 等，2021）。 許多因素能夠影響動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)及微生物多樣性。研究表明，多種霉菌毒素可降低動(dòng)物腸道微生物多樣性， 造成腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂 （劉錦芳等，2019；Payros 等，2017；楊俊花等，2016）。過(guò)度繁殖的有害菌會(huì)打破腸道正常菌群的生態(tài)平衡， 降低腸道微生物多樣性，破壞腸黏膜屏障功能（Xing 等，2021）。 當(dāng)前，我國(guó)配合飼料普遍受到低劑量霉菌毒素[含量在我國(guó)《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB 13078—2017）限定范圍內(nèi)]污染（丁燕玲等，2021），同時(shí)動(dòng)物飼料中已全面禁止添加促生長(zhǎng)類抗生素。 因此，探尋安全、有效的飼料添加劑來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群， 改善腸道健康是實(shí)現(xiàn)蛋雞高效生產(chǎn)的重要課題。目前，應(yīng)用較為廣泛的霉菌毒素脫毒方法是在飼料中添加霉菌毒素吸附劑（MA），蒙脫石等硅鋁酸鹽類MA能夠吸附多種霉菌毒素， 有效干預(yù)霉菌毒素對(duì)動(dòng)物健康造成的負(fù)面影響（Yang 等，2014；Wan 等，2013）。 植物精油（EO）和有機(jī)酸（OA）具有良好的防霉、抗菌、抑炎等作用，可調(diào)節(jié)家禽腸道菌群結(jié)構(gòu)， 改善腸道健康（張嘉琦等，2021； 馬嘉瑜等，2021；Hamid 等，2018）。 然而，應(yīng)用單一飼料添加劑難以有效替代飼用抗生素及干預(yù)霉菌毒素的毒性?；贛A、OA 和EO 的功能，推測(cè)MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物也許能有效控制霉菌毒素、 有害菌等對(duì)蛋雞的危害， 調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高微生物多樣性，改善腸道健康。 另外，研究發(fā)現(xiàn)，添加MA-OA 復(fù)合物、MA-EO 復(fù)合物有提高蛋雞產(chǎn)蛋率的趨勢(shì)，顯著提高了蛋重（陳繼發(fā)和耿曉峰，2020）， 推測(cè)可能與二者調(diào)節(jié)蛋雞腸道菌群有關(guān)。 因此，本試驗(yàn)在含有多種低濃度霉菌毒素飼糧中添加MA-OA 復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物，研究其對(duì)蛋雞盲腸微生物多樣性、菌群結(jié)構(gòu)及物種豐度的影響， 為二者在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 MA-EO 復(fù)合物主要成分為：MA（蒙脫石）75%，EO （主要為丁香酚和肉桂醛）含量> 4%；MA-OA 復(fù)合物成主要分為：MA （蒙脫石）80%，OA（主要為甲酸、丙酸和丁酸）>10%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 將270 只29 周齡的健康羅曼蛋雞隨機(jī)分為3 組，每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 只。 對(duì)照組（CON 組）飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.70 g/kg MA-EO復(fù)合物 （MEO 組） 和0.65 g/kg MA-OA 復(fù)合物（MOA 組）的試驗(yàn)飼糧。 預(yù)試期1 周，正試期10周。 基礎(chǔ)飼糧參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33-2004）設(shè)計(jì)， 其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)陳繼發(fā)和耿曉峰（2020）文獻(xiàn)。

蛋雞采用3 層階梯式籠養(yǎng)，每籠飼養(yǎng)3 只。試驗(yàn)1 ~ 10 周雞舍平均溫度、相對(duì)濕度分別為（26±3）℃、（77±6）%。 每日喂料2 次，自由飲水，光照時(shí)間為16 h/d。

1.3 樣品采集 試驗(yàn)第70 天， 從各重復(fù)隨機(jī)抽取1 只蛋雞，參照曲湘勇等（2019）的方法采集蛋雞盲腸內(nèi)容物樣品。

1.4 腸道微生物分析 提取蛋雞盲腸內(nèi)容物細(xì)菌DNA 后， 采用通用引物338F/806R 對(duì)細(xì)菌16S rRNA V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物， 用AxyPreP DNA Gel Extraction Kit 進(jìn)行純化，QuantusTMFlurometer 進(jìn)行定量檢測(cè)，使用NEXTFLEXRRepid DNA-Seq PE300平臺(tái)測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析 盲腸微生物原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，F(xiàn)lash 軟件拼接。對(duì)優(yōu)化后的序列根據(jù)97%的相似度進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類，對(duì)生成的OTU 信息進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析。 數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)， 用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P< 0.05 表示差異顯著，0.05≤P< 0.10 表示有變化的趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群測(cè)序數(shù)據(jù)與α 多樣性的影響 由表1可知，各組樣品測(cè)序覆蓋率均在99.6%以上，說(shuō)明測(cè)序深度已基本覆蓋到樣品中的所有物種。 MOA組、MEO 組樣品測(cè)序獲得的有效序列和盲腸菌群Shannon 指 數(shù)、Ace 指 數(shù)、Chao 指 數(shù) 較CON 組 均有不同程度的提高（P> 0.05）。

表1 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群測(cè)序數(shù)據(jù)與α 多樣性的影響

2.2 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群β 多樣性的影響 如圖1 所示，CON組、MEO 組菌群結(jié)構(gòu)分布相對(duì)緊湊， 說(shuō)明其物種相似度較高。 而MOA 組菌群結(jié)構(gòu)分布相對(duì)分散，說(shuō)明其物種相似度較低，群落構(gòu)成差異較大。

圖1 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群β 多樣性的影響

2.3 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群物種豐度的影響

2.3.1 門水平 由表2 可知，在門水平上，各組中相對(duì)豐度大于1%的菌門有擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和梭桿菌門， 其中擬桿菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，占比達(dá)到90%左右。 各組間相對(duì)豐度大于0.15%的菌門相對(duì)豐度均無(wú)顯著差異（P>0.05）。與CON 組相比，MOA 組、MEO 組綠灣菌門相對(duì)豐度顯著降低（P< 0.05）。

表2 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群門水平上相對(duì)豐度的影響

2.3.2 屬水平 由表3 可知， 各組間蛋雞盲腸優(yōu)勢(shì)菌屬存在一定差異， 且以擬桿菌屬相對(duì)豐度最高，其序列約占測(cè)序總量的32%。 CON 組相對(duì)豐度排前4 的菌屬依次為擬桿菌屬、 未明確瘤胃菌科、理研菌科RC9 群和考拉桿菌屬；MOA 組相對(duì)豐度排前4 的菌屬依次為擬桿菌屬、 理研菌科RC9 群、考拉桿菌屬和柔嫩梭菌屬；而MEO 組相對(duì)豐度排前4 的菌屬依次為擬桿菌屬、 理研菌科RC9 群、考拉桿菌屬和柔嫩梭菌屬。 與CON 組相比，MEO 組、MOA 組理研菌屬相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì)（P=0.099），腸球菌屬相對(duì)豐度有降低的趨勢(shì)（P=0.097），大腸志賀氏桿菌、梭桿菌屬相對(duì)豐度有不同程度的降低（P> 0.05），乳酸桿菌屬相對(duì)豐度有不同程度的提高 （P> 0.05）；MOA 組帕拉普氏菌屬、 未明確厭氧繩菌科和未明確亞硝化單胞菌科相對(duì)豐度顯著降低（P< 0.05），瘤胃梭菌屬_1 相對(duì)豐度顯著提高（P< 0.05），未明確克里斯滕森菌科、 不動(dòng)桿菌屬和丁酸球菌屬相對(duì)豐度有提高的趨勢(shì)（0.05≤P< 0.10），雙歧桿菌屬相對(duì)豐度有不同程度的提高（P> 0.05）。

表3 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群屬水平上相對(duì)豐度的影響

2.4 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸差異微生物的影響 通過(guò)LEfSe 分析屬水平上具有顯著差異的微生物 （圖2）。 與CON 組相比，MOA 組乳酸桿菌屬、瘤胃梭菌屬_1、瘤胃菌科V9D2013 群、未明確克里斯滕森菌科和理研菌屬等顯著富集；MEO 組未明確消化球菌科和未分類厚壁菌門顯著富集。與MEO 組相比，MOA 組臭氣桿菌屬、丁酸球菌屬、瘤胃梭菌屬_1、克里斯滕森菌科R_7 群、未明確克里斯滕森菌科和瘤胃菌科_UCG-014 等顯著富集。

圖2 差異微生物L(fēng)EfSe 分析

3 討論

3.1 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群多樣性的影響 腸道菌群多樣性與菌群穩(wěn)定性、機(jī)體新陳代謝及免疫防御能力等呈正相關(guān)（Butel，2014）。 本試驗(yàn)中，各組樣品間α 多樣性指數(shù)均無(wú)顯著差異， 但MEO 組、MOA 組Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)較CON 組均有一定提高。 另外，經(jīng)PCoA方法分析β 多樣性發(fā)現(xiàn)，MOA 組菌群結(jié)構(gòu)分布相對(duì)零散，相似度較低，提示樣品中群落構(gòu)成差異較大。 以上試驗(yàn)結(jié)果提示MA-OA 復(fù)合物和MA-EO復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群多樣性的影響是正面的。研究發(fā)現(xiàn)，在含有多種低劑量霉菌毒素飼糧中添加蒙脫石對(duì)蛋雞盲腸菌群α 多樣性和β 多樣性無(wú)顯著影響（陳繼發(fā)，2017）。容庭等（2018）研究表明，添加0.2%、0.3%酸化劑對(duì)肉雞回腸菌群多樣性沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。 Feng 等（2021）報(bào)道，飼糧中添加牛至精油對(duì)蛋雞回腸菌群Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均無(wú)顯著影響，但在一定程度上提高了回腸菌群β 多樣性。 以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。 研究證實(shí)，多種霉菌毒素對(duì)動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)及微生物多樣性會(huì)造成顯著負(fù)面影響（Liu 等，2019；Payros 等，2017；Yang 等，2016）。 本試驗(yàn)蛋雞飼糧被多種霉菌毒素污染，但毒素含量處于安全范圍內(nèi)（陳繼發(fā)和耿曉峰，2020），其可能不會(huì)顯著降低蛋雞腸道微生物多樣性， 進(jìn)而添加MA-OA 復(fù)合物、MA-EO 復(fù)合物沒(méi)有對(duì)蛋雞腸道菌群多樣性產(chǎn)生顯著影響。

3.2 MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)和物種豐度的影響 家禽腸道菌群主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成（程浩等，2021；曲湘勇等，2019）。本試驗(yàn)中蛋雞盲腸菌群擬桿菌門和厚壁菌門占比達(dá)到90%， 與前人的研究結(jié)果基本一致。 添加MA-EO 復(fù)合物和MA-OA 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，可能與健康成年蛋雞腸道內(nèi)已形成穩(wěn)定的微生物區(qū)系有關(guān)。 在門水平上，MEO 組、MOA 組綠灣菌門相對(duì)豐度較CON 組顯著降低。 綠灣菌門是一類通過(guò)光合作用產(chǎn)生能量的細(xì)菌， 是一種化能異養(yǎng)型細(xì)菌。 研究指出，綠灣菌門相對(duì)豐度與含水量呈負(fù)相關(guān)（康寶天等，2020）。本研究中，試驗(yàn)組綠灣菌門相對(duì)豐度顯著降低，可能是由于飼料中添加了具有吸水性的蒙脫石。 另外， 本研究發(fā)現(xiàn)，MEO 組、MOA組梭桿菌門相對(duì)豐度較CON 組分別降低了43.71%、63.47%。Gao 等（2017）報(bào)道，結(jié)直腸癌患者腸道梭桿菌門相對(duì)豐度顯著升高，提示此菌門豐度增加與腸道疾病有關(guān)。

在屬水平上，MA-OA 復(fù)合物和MA-EO 復(fù)合物對(duì)蛋雞盲腸菌群優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響， 但在一定程度上優(yōu)化了菌群結(jié)構(gòu)。 MEO 組、MOA 組大腸志賀氏桿菌、梭桿菌屬和腸球菌屬相對(duì)豐度較CON 組均有一定降低。 大腸志賀氏桿菌是腸道致病菌，可誘發(fā)腸炎，釋放細(xì)菌毒素，引起細(xì)菌及毒素“移位”。梭桿菌屬包含壞死梭桿菌、潰瘍梭桿菌和核梭桿菌等多種致病菌。苗慧芳等（2014）報(bào)道，與健康人相比，結(jié)直腸癌患者糞便中梭桿菌屬相對(duì)豐度顯著升高；Gao 等（2017）研究表明，梭桿菌屬被鑒定為結(jié)直腸癌發(fā)生的關(guān)鍵因素，說(shuō)明此菌屬豐度提高與消化道疾病有關(guān)。 腸球菌屬是革蘭氏陽(yáng)性菌中僅次于葡萄球菌屬的重要醫(yī)院感染病原菌，可引起尿路感染、腹部創(chuàng)傷和術(shù)后感染。

同時(shí)，經(jīng)LEfSe 分析發(fā)現(xiàn)，添加MA-OA 復(fù)合物使蛋雞盲腸乳酸桿菌屬、未明確克里斯滕森菌科和理研菌屬顯著富集，且一定程度上提高了丁酸球菌屬和雙歧桿菌屬相對(duì)豐度。乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬是家禽腸道中有益菌群， 對(duì)宿主發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)、代謝和免疫等多重生理功能， 有利于維護(hù)宿主健康（Fukuda 等，2011）。 丁酸球菌屬是腸道中優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)丁酸菌，能發(fā)酵各種碳水化合物生成丁酸，丁酸可為腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量（Fukuda 等，2011）。 據(jù)報(bào)道， 理研菌屬是腸道內(nèi)具有保護(hù)性功能的菌群，楊俊花等（2016）研究表明，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇顯著降低了小鼠腸道理研菌屬相對(duì)豐度。本試驗(yàn)蛋雞飼糧中含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等多種霉菌毒素（陳繼發(fā)和耿曉峰，2020）， 提示添加MA-OA 復(fù)合物可能干預(yù)低濃度霉菌毒素對(duì)蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)造成的負(fù)面影響。 克里斯滕森菌科屬于厚壁菌門，其與炎癥性腸病、 代謝綜合征等顯著負(fù)相關(guān)（Waters 等，2019）。另外，LEfSe 分析顯示，與MEO 組相比，MOA 組丁酸球菌屬、 克里斯滕森菌科R_7 群、未明確克里斯滕森菌科等顯著富集， 提示添加MA-OA 復(fù)合物對(duì)提高有益菌屬豐度的作用優(yōu)于MA-EO 復(fù)合物， 可能與OA 能夠降低腸道pH，抑制有害菌生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌增殖有關(guān)。綜上所述，添加MA-EO 復(fù)合物和MA-OA 復(fù)合物在一定程度上降低了部分有害菌屬相對(duì)豐度，MA-OA 復(fù)合物可促進(jìn)部分有益菌屬富集，說(shuō)明其可調(diào)節(jié)蛋雞盲腸菌群結(jié)構(gòu)，這可能是二者在一定程度上提高蛋雞生產(chǎn)性能（陳繼發(fā)和耿曉峰，2020）的主要原因之一。

4 結(jié)論

飼糧添加0.65 g/kg MA-OA 復(fù)合物能夠在一定程度上提高蛋雞盲腸微生物多樣性， 優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)。