李 萍，蘇佳麗，杜欣軍，王 碩

(1.食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457； 2.天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071)

膳食成分會(huì)顯著調(diào)節(jié)腸道菌群，影響腸道代謝功能[1].目前大量研究表明膳食中的多糖、纖維以及一些植物提取物等均有一定的抑菌作用.Sweeney等[2]發(fā)現(xiàn)海藻多糖可以促進(jìn)乳酸桿菌的生長(zhǎng)，抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌的繁殖.另一項(xiàng)研究[3]發(fā)現(xiàn)可發(fā)酵纖維菊粉可以抑制艱難梭菌的繁殖.Parson等[4]發(fā)現(xiàn)食用可溶性車(chē)前草纖維可以防止鼠傷寒沙門(mén)氏菌入侵雞的腸黏膜.此外，還有研究表明檳榔[5]、茶籽殼[6]、石榴 皮[7]、黑豆花色苷[8]、綠茶和葡萄籽[9]等均對(duì)一些致病菌有顯著的抑制作用.

豆科在中國(guó)有172個(gè)屬，其中食用類(lèi)最常見(jiàn)的是大豆和赤小豆.大豆也稱(chēng)為黃豆，為雙子葉植物綱豆科大豆屬，其種子含有豐富的蛋白質(zhì).大豆異黃酮[10]在抑菌、免疫方面有顯著作用.將大豆中的油榨取之后所剩下的大豆豆粕是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料，常被添加進(jìn)動(dòng)物飲食中.赤小豆也稱(chēng)為赤豆、朱豆，為雙子葉植物綱豆科豇豆屬，其作為藥食同源的物質(zhì)之一，主要含有黃酮類(lèi)化合物和膳食纖維等物質(zhì)，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗菌、降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)血糖等多種作用[11].研究[12]表明，赤小豆乙醇提取物可以減輕醋酸性結(jié)腸炎大鼠的體質(zhì)量損失，降低相應(yīng)炎癥指標(biāo)水平，保護(hù)大鼠的結(jié)腸免受損傷.Park等[13]采用體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了赤小豆提取物可以改善小鼠敗血癥的死亡情況，調(diào)節(jié)炎癥水平.大豆和赤小豆中的成分均被報(bào)道有抑菌、增強(qiáng)免疫力等功能，可能對(duì)食源性致病菌侵染導(dǎo)致的腸炎有一定的緩解作用.

鼠傷寒沙門(mén)氏菌是一種常見(jiàn)的全球食源性病原體，幾乎可以侵染一切動(dòng)物，可引起多種人畜疾病，包括急性腸胃炎、菌血癥及腸外局部感染[14].經(jīng)過(guò)研究相關(guān)數(shù)據(jù)，沙門(mén)氏菌感染比其他任何細(xì)菌病原體感染造成的死亡人數(shù)都多，大多數(shù)沙門(mén)氏菌病通過(guò)食物傳播，其中鼠傷寒沙門(mén)氏菌通常在牛、豬和雞中被發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)通常通過(guò)食用未煮熟或受污染的食物而感 染[14-15].在沙門(mén)氏菌的感染病例中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌約占三分之一，且鼠傷寒沙門(mén)氏菌是從致命沙門(mén)氏菌感染患者體內(nèi)分離出來(lái)的最常見(jiàn)的沙門(mén)氏菌血清 型[15].鼠傷寒沙門(mén)氏菌可以在多種宿主中引起腸道感染，尤其是溫血?jiǎng)游锔腥敬蠖嘤墒髠抽T(mén)氏菌引起[16].鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028可以通過(guò)口腔進(jìn)入消化道，侵入小腸黏膜上皮細(xì)胞，隨后定殖于肝臟和脾臟中，并通過(guò)血液傳播到全身各個(gè)部位，引起機(jī)體不良反應(yīng)[17].目前臨床針對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的感染主要使用抗生素藥物進(jìn)行治療，如喹諾酮和頭孢曲松等[18]，但也因此出現(xiàn)了耐藥性，而飲食干預(yù)作為新的防治手段，還沒(méi)有應(yīng)用到沙門(mén)氏菌侵染的疾病治療中.BALB/c小鼠對(duì)沙門(mén)氏菌較為敏感，會(huì)患上一種類(lèi)似人類(lèi)傷寒的全身性致命疾病[19].目前針對(duì)結(jié)腸炎等胃腸道疾病的研究[20]主要通過(guò)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)，本研究直接使用鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行侵染，更直觀地反映出人類(lèi)受到致病菌侵染時(shí)的一系列免疫反應(yīng).小鼠基礎(chǔ)飼料中含有一定量的大豆豆粕，而大豆和赤小豆中的成分均被報(bào)道有抑菌、增強(qiáng)免疫等功能，可能對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染導(dǎo)致的腸炎有一定的緩解作用.因此，本研究使用玉米淀粉或者赤小豆代替豆粕部分，通過(guò)調(diào)整飼料中的豆類(lèi)對(duì)小鼠進(jìn)行膳食干預(yù)，探討其對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌引起的急性腸炎的緩解作用.

1 材料與方法

1.1 材料

無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)BALB/c雌性小鼠，6周齡，斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)為SCXK(京)2019—0010；鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella entericaserotype Typhimurium) ATCC14028，天津科技大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；小鼠飼料，納瑞增(天津)生物科技有限公司.

蘆丁，上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉，阿拉丁試劑(上海)有限公司；硝酸鋁，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；氫氧化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇，天津市百世化工有限公司；沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；玉米淀粉，南京甘汁園糖業(yè)有限公司；明膠(食品級(jí))，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；赤小豆，安徽燕之坊食品有限公司；大豆豆粕，納瑞增(天津)生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、小鼠白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，南京建成科技有限公司.

HCJ-4C型磁力攪拌水浴鍋，蘇州東鵬儀器制造有限公司；K480-22H型超聲波清洗儀，昆山歐華超聲科技有限公司；5424C150339型臺(tái)式離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；LBI-250型生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；SCIENTA-48型高通量組織研磨機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；OHG-914385型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MR–96A型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)選用50只SPF級(jí)6周齡的BALB/c雌性小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，小鼠每籠5只，在相對(duì)濕度60%～80%、溫度(22±2)℃、光/暗周期12h/12h的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由取食和飲水.所有小鼠進(jìn)行基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)適應(yīng)1周，適應(yīng)期結(jié)束后實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為淀粉正常組(starch control group，ST)、淀粉侵染組(starch infection group，STI)、大豆豆粕侵染組(soybean meal infection group，SBMI)、5%赤小豆侵染組(5% red bean infection group，5%RBI)、10%赤小豆侵染組(10% red bean infection group，10%RBI).淀粉正常組和淀粉侵染組繼續(xù)喂食普通飼料，其余3組喂食相應(yīng)飼料4周進(jìn)行膳食干預(yù)，每周稱(chēng)量一次小鼠體質(zhì)量并記錄.在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始5周后每組選取狀態(tài)最好的8只開(kāi)始進(jìn)行灌胃，侵染組灌胃鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌懸液，每只小鼠單次的灌胃菌數(shù)為1.0×107個(gè)，菌懸液體積為0.1mL，連續(xù)灌胃6d，正常組灌胃相同體積的生理鹽水.其間每天記錄小鼠體質(zhì)量與死亡情況，在第3天與第6天對(duì)小鼠糞便中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌進(jìn)行計(jì)數(shù).鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行眼球取血并測(cè)定血清中的炎癥因子，斷頸后解剖小鼠，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并對(duì)結(jié)腸進(jìn)行病理切片[21-22].

1.2.2 鼠傷寒沙門(mén)氏菌菌懸液的制備

從-80℃冰箱中取出鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC 14028，在溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)固體平板培養(yǎng)基上劃線，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20h；挑取單菌落置于LB液體試管培養(yǎng)基中，37℃、200r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng).將培養(yǎng)后的菌液以1∶100的比例轉(zhuǎn)接至新的LB液體試管培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(A600＝0.6～1)后，取部分菌液置于離心管中，4℃、10000r/min離心30s，棄去上清液后加入相同體積的無(wú)菌生理鹽水重新懸浮，再次離心，重復(fù)兩次以洗去培養(yǎng)基；再用生理鹽水懸浮細(xì)菌，使菌體濃度為1.0×107mL-1(菌體濃度用平板計(jì)數(shù)確定)[21].

1.2.3 飼料的配方與制備方法

小鼠飼料配方見(jiàn)表1.

表1 小鼠飼料配方 Tab.1 Mouse feed formula

飼料制備時(shí)，按照表1稱(chēng)量好所有物料并混合，將預(yù)先制備好的食品級(jí)明膠水溶液(40g明膠在800mL常溫水中浸泡3～4h，70℃水浴30min使其充分溶解)加到1000g飼料中攪拌，和成飼料面團(tuán).將和好的飼料面團(tuán)搓成長(zhǎng)度約為4～6cm、直徑約為1cm的圓柱，放入烘箱60℃烘干.

1.2.4 小鼠飼料成分含量的測(cè)定

淀粉含量參照GB 5009.9—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中淀粉的測(cè)定》中的酸水解法進(jìn)行測(cè)定.脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》中的索氏抽提法進(jìn)行測(cè)定.蛋白質(zhì)含量參照SN/T 3926—2014《出口乳、蛋、豆類(lèi)食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)法》進(jìn)行測(cè)定.膳食纖維含量參照GB 5009.88—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定.

黃酮含量的測(cè)定[23]：以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法在510nm下檢測(cè)吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程.將待測(cè)樣品溶于20倍體積的80%乙醇溶液中，60℃水浴冷凝回流90min，超聲提取20min，過(guò)濾；濾渣繼續(xù)用80%乙醇溶液超聲提取1次，記錄濾液的總體積.取適量濾液，12000r/min離心10min，留上清液為樣品溶液備用.吸取樣品溶液2mL置于10mL容量瓶中，后續(xù)按照標(biāo)準(zhǔn)溶液的步驟操作，在510nm下檢測(cè)吸光度.

1.2.5 生理生化指標(biāo)的測(cè)定方法

鼠傷寒沙門(mén)氏菌涂板計(jì)數(shù)：取0.1g新鮮糞便用無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍，研磨制成均勻的菌懸液，取適量涂布于預(yù)先制好的沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的菌數(shù)(N).分別檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染第3天與第6天的糞便樣本.

糞便黃酮含量的測(cè)定：參照1.2.4節(jié)中的方法進(jìn)行測(cè)定.分別檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌未侵染與侵染第6天的糞便樣本.

結(jié)腸長(zhǎng)度：在鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染結(jié)束后，解剖小鼠取結(jié)腸，并對(duì)其長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量與記錄.

小鼠血清炎癥因子濃度的測(cè)定：使用ELISA試劑盒測(cè)定小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-10的質(zhì)量濃度，操作時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明的步驟進(jìn)行.其 中，血清在鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染結(jié)束后取得，為侵染第6天的樣本.

腸道切片：腸道組織樣本使用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin and eosin staining，HE)染色，即取3mm厚的組織樣本進(jìn)行脫水、石蠟包埋，取4μm厚的切片在HE染色后進(jìn)行全景掃描.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7.04進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)用于計(jì)算各因素之間的相關(guān)關(guān)系，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆豆粕與赤小豆飼料成分含量的對(duì)比

小鼠飼料中膳食成分的含量對(duì)比見(jiàn)表2.由表2可以看出：4種飼料中的主要膳食成分(淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)與膳食纖維)含量之間沒(méi)有顯著性差異；在黃酮含量上，ST飼料與SBM飼料之間沒(méi)有顯著性差異，而RB飼料的黃酮含量顯著高于ST與SBM飼料的.

表2 小鼠飼料中膳食成分的含量對(duì)比 Tab.2 Comparison of dietary components in the feed of mice

2.2 小鼠生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 小鼠飼養(yǎng)與灌胃侵染期間的體質(zhì)量

在人們的日常飲食中，對(duì)雞蛋、牛奶、豬肉、雞肉、牛肉等食品的攝入是最為常見(jiàn)的，而這些都屬于動(dòng)物性食品。因此，加強(qiáng)動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫工作，減少動(dòng)物性食品安全問(wèn)題的發(fā)生，對(duì)保障人們的健康和國(guó)家的穩(wěn)固發(fā)展具有重大意義[1]。

適應(yīng)期與膳食干預(yù)期的小鼠體質(zhì)量如圖1所示.

圖1 適應(yīng)期與膳食干預(yù)期的小鼠體質(zhì)量 Fig.1 Body weight of mice at the adaptive stage and the dietary intervention stage

從圖1中可以看出：在前5周的適應(yīng)與膳食干預(yù)期間，5組小鼠的體質(zhì)量都呈上升趨勢(shì)，組間無(wú)顯著性差異.由表2可知：4種飼料的主要膳食成分大體一致，只有黃酮含量存在差異，說(shuō)明黃酮含量的差異并未明顯影響小鼠的體質(zhì)量.

鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染期間的小鼠體質(zhì)量如圖2所示.從圖2中可以看出：在灌胃期間，由于鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染小鼠腸道，所有鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染組小鼠的體質(zhì)量均顯著下降，SBMI組小鼠的體質(zhì)量最先降低；由于赤小豆中含有可以抵抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌的功能成分[24]，使得RBI組小鼠的體質(zhì)量在侵染初期維持平穩(wěn)了一段時(shí)間，體質(zhì)量損失發(fā)生的時(shí)間最晚.在侵染后期，由于小鼠體內(nèi)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的積累，使其不適反應(yīng)更加強(qiáng)烈，活動(dòng)緩慢，進(jìn)食減少，使小鼠體質(zhì)量出現(xiàn)下降趨勢(shì).因此可以推測(cè)，在鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染期間，攝入適量的赤小豆可以有助于短暫維持小鼠體質(zhì)量，減緩侵染引起的不良反應(yīng).

圖2 鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染期間的小鼠體質(zhì)量 Fig.2 Body weight of mice during S.Typhimurium infection

2.2.2 小鼠存活率

小鼠在受到鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染后，起初表現(xiàn)為進(jìn)食量減少、行動(dòng)遲緩及毛發(fā)失去光澤等癥狀；隨著侵染次數(shù)的增加，小鼠會(huì)出現(xiàn)身體蜷縮、顫抖、腹瀉甚至死亡等較為嚴(yán)重的癥狀.鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染期間小鼠的存活率如圖3所示.從圖3中可以看出：侵染結(jié)束，ST組沒(méi)有發(fā)生死亡，STI組、SBMI組、10%RBI組死亡率均為50%，而5%RBI組存活率為75%，明顯高于其他侵染組.這說(shuō)明5%的赤小豆攝入在鼠傷寒沙門(mén)氏菌持續(xù)侵染過(guò)程中可以緩解小鼠的死亡情況.

圖3 鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染期間小鼠的存活率 Fig.3 Survival of mice during S.Typhimurium infection

2.2.3 小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度

從圖4中可以看出：未受侵染的ST組小鼠的結(jié)腸最長(zhǎng)，受侵染小鼠的結(jié)腸均較短；從均值來(lái)看，SBMI組與5%RBI組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度可以達(dá)到與ST組的相近的狀態(tài)，而STI組與10%RBI組小鼠的結(jié)腸均較短.但是，由于小鼠之間差異較大，誤差較高，使得不同組之間在結(jié)腸長(zhǎng)度上沒(méi)有顯著性差異.

圖4 小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度 Fig.4 Colon length of mice

2.2.4 小鼠糞便鼠傷寒沙門(mén)氏菌涂板計(jì)數(shù)結(jié)果

灌胃期間，由于對(duì)小鼠進(jìn)行了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的侵染，該菌在小鼠腸道中定殖，使得糞便中也存在該菌.使用小鼠糞便進(jìn)行平板涂布，侵染第3天和第6天小鼠糞便的鼠傷寒沙門(mén)氏菌涂板計(jì)數(shù)結(jié)果如圖5所示.

圖5 侵染第3天和第6天小鼠糞便的鼠傷寒沙門(mén)氏菌涂板計(jì)數(shù) Fig.5 Count of S.Typhimurium in feces of mice on day 3 and 6 after infection

由圖5可以看出：與第3天相比，隨著灌胃時(shí)間的增加，小鼠糞便中鼠傷寒沙門(mén)氏菌的含量在第6天明顯增加，發(fā)生了數(shù)量級(jí)變化，而且STI組的鼠傷寒沙門(mén)氏菌數(shù)量均顯著高于其他3組，說(shuō)明STI組抵抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染能力最弱.在第6天，5%RBI組的菌含量顯著低于其他3組，說(shuō)明改善結(jié)腸炎的作用可能與減少鼠傷寒沙門(mén)氏菌在小鼠腸道中的定殖有關(guān).而與STI組相比，10%RBI組雖然也表現(xiàn)出較少的鼠傷寒沙門(mén)氏菌定殖，但還是顯著高于5%RBI組.結(jié)果表明，大豆和赤小豆的攝入均可以改善鼠傷寒沙門(mén)氏菌在小鼠腸道中的定殖，而5%赤小豆的攝入產(chǎn)生了更好的抑制效果.因此可以推測(cè)，適當(dāng)?shù)某嘈《箶z入可以幫助小鼠抵御鼠傷寒沙門(mén)氏菌的侵染，但并不是越多越好.

2.2.5 小鼠糞便中總黃酮含量

研究[28]表明，黃酮類(lèi)化合物具有抗病毒、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等作用.侵染前后小鼠糞便中的總黃酮含量如圖6所示.

圖6 侵染前后小鼠糞便中的總黃酮含量 Fig.6 Total flavonoid content in feces of mice before and after infection

從表2可以看出，ST飼料和SBM飼料中的黃酮含量極少，幾乎沒(méi)有，而5%RB飼料中的黃酮含量是前兩者的7倍，10%RB飼料中的黃酮含量是前兩者的14倍.由圖6可知：RBI組的黃酮含量遠(yuǎn)高于其他組，STI組與SBMI組在侵染前沒(méi)有明顯的差異，而侵染后，SBMI組的黃酮含量顯著低于STI組，且在侵染后5%RBI組的黃酮含量明顯升高，10%RBI組卻顯著下降.因此，RB飼料對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抑制作用可能主要與黃酮的存在有關(guān).有研究[29-30]表明，嚴(yán)重的沙門(mén)氏菌侵染會(huì)使宿主體內(nèi)總超氧化物歧化酶(T-SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的含量降低，這可能導(dǎo)致宿主處于嚴(yán)重的氧化應(yīng)激狀態(tài)，腸道內(nèi)的黃酮類(lèi)化合物更容易被氧化分解.鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染后引起的腸道炎癥，可能導(dǎo)致宿主吸收效率降低，從而表現(xiàn)為糞便中的黃酮含量升高.因此，糞便中的黃酮含量較侵染前升高或降低會(huì)受炎癥程度的影響.SBMI組侵染前后，糞便中的黃酮含量無(wú)顯著性差異，始終處于較低水平，但整體表現(xiàn)為降低的趨勢(shì)，與10%RBI組表現(xiàn)類(lèi)似.這可能是由于鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染導(dǎo)致小鼠腸道處于高氧化環(huán)境，使黃酮發(fā)生嚴(yán)重氧化，含量明顯降低.而5%RBI組侵染前糞便中的黃酮含量與STI組之間無(wú)顯著性差異，但5%RB飼料中的黃酮含量顯著高于ST組和SBMI組，證明5%RB飼料中的黃酮大部分被小鼠吸收，而侵染后輕微的腸道炎癥可能導(dǎo)致宿主吸收效率降低，從而表現(xiàn)出糞便中的黃酮含量升高.

從表2、圖5和圖6中可以看出：STI組與SBMI組由于其飼料中黃酮含量極低，黃酮在小鼠體內(nèi)積累量減少，糞便檢出量也較少；當(dāng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染時(shí)，細(xì)菌正常定殖，數(shù)量增多，糞便中檢出的鼠傷寒沙門(mén)氏菌濃度較高.相反，RBI組小鼠在一個(gè)月的膳食干預(yù)期攝入了較多的黃酮，幫助調(diào)節(jié)腸道，因此當(dāng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染時(shí)，它可以幫助抵抗致病菌的侵害，糞便中的黃酮含量和鼠傷寒沙門(mén)氏菌計(jì)數(shù)恰好印證了這一點(diǎn).然而，與5%RB飼料相比，10%RB飼料含有更高含量的黃酮，糞便中的黃酮含量也較高，但喂食10%RB飼料的小鼠并沒(méi)有比喂食5%RB飼料的小鼠更能抵抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌的侵染，反而糞便中鼠傷寒沙門(mén)氏菌數(shù)量更高.這可能是由于高含量的黃酮類(lèi)化合物并沒(méi)有讓小鼠全部吸收，在侵染期間腸道的高氧化環(huán)境反而使其氧化損失.因此，攝入適量的黃酮可以更好地抵抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌的侵染，但并不是越多越好，這進(jìn)一步驗(yàn)證了之前的推斷.

為了進(jìn)一步了解疾病相關(guān)指標(biāo)(死亡率、鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量和體質(zhì)量)與飼料膳食成分(淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、膳食纖維和黃酮)之間的相關(guān)性，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)(相關(guān)系數(shù)為1，表示完全正相關(guān)；相關(guān)系數(shù)為－1，表示完全負(fù)相關(guān)；相關(guān)系數(shù)越接近于0，表示相關(guān)性越弱；相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值越大，表示相關(guān)性越強(qiáng)).Pearson相關(guān)系數(shù)結(jié)果如圖7所示.

圖7 皮爾遜相關(guān)系數(shù) Fig.7 Pearson correlation coefficient

從圖7可以看出：黃酮含量與死亡率、鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量、體質(zhì)量均為負(fù)相關(guān)，其中與鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量和死亡率的相關(guān)性較強(qiáng)，與體質(zhì)量的相關(guān)性相對(duì)較弱；膳食纖維含量與鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量為負(fù)相關(guān)；淀粉、脂肪和蛋白質(zhì)與小鼠其他疾病表現(xiàn)均為弱相關(guān).這說(shuō)明飼料中的黃酮類(lèi)化合物可能幫助小鼠抵抗鼠傷寒沙門(mén)氏菌的侵染，減少死亡.

當(dāng)然，赤小豆飼料對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的抑制作用也并不能完全歸因于黃酮的存在，一些其他的微量物質(zhì)也可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響.例如錳[31]、鋅[32]、鐵[33]等微量元素作為人體必需的營(yíng)養(yǎng)元素也可能在一定程度上影響致病菌侵染的進(jìn)程，還有豆類(lèi)中的皂苷、膳食纖維等物質(zhì)也具有一定的抗菌活性[34-35].從圖7中也可以看出，膳食纖維含量與鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量呈負(fù)相關(guān).

2.2.6 腸道切片

由于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的侵染，細(xì)菌在腸道中定 殖，參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，破壞腸道上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞.對(duì)各組小鼠的結(jié)腸進(jìn)行切片染色，觀察其腸道形態(tài)，如圖8所示.與ST組相比，STI組經(jīng)鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染后絨毛結(jié)構(gòu)松散，脫離腸壁，結(jié)腸內(nèi)部無(wú)完整形態(tài)；而經(jīng)過(guò)大豆豆粕和赤小豆膳食補(bǔ)充的小鼠基本保持著腸道完整性，絨毛排列相對(duì)整齊，腸壁無(wú)明顯的損傷，其中5%RBI組小鼠的腸道內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)最為完整，更接近于ST組.這進(jìn)一步驗(yàn)證了大豆豆粕與赤小豆的膳食干預(yù)明顯緩解了小鼠的腸道炎癥，幫助小鼠維持腸屏障的完整性，減輕鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染導(dǎo)致的腸道損傷.

圖8 小鼠結(jié)腸切片 Fig.8 Colon section of mouse

2.2.7 小鼠血清中炎癥因子的濃度

腸道在受到嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)會(huì)釋放大量的TNF-α、IL-1β等促炎因子和IL-10等抗炎因子，小鼠血清中炎癥因子的濃度可以反映小鼠腸道受損傷的嚴(yán)重程度[36-38].TNF-α在免疫反應(yīng)中既可以作為促炎介質(zhì)，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，又可以作為免疫抑制介質(zhì)，抑制自身免疫性疾病的發(fā)展和腫瘤的發(fā)生，在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[39].IL-1家族有4種拮抗因子與7種促炎因子，IL-1β作為促炎因子之一可以調(diào)節(jié)免疫、修復(fù)損傷[40].IL-10是一種作用廣泛的抗炎細(xì)胞因子，可以抑制單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等.小鼠血清中炎癥因子的質(zhì)量濃度如圖9所示.

從圖9(a)和圖9(b)可以看出：ST組小鼠未受侵 染，因此TNF-α和IL-1β的含量都極低，而STI組的含量均最高，這說(shuō)明STI組的小鼠炎癥最嚴(yán)重，鼠傷寒沙門(mén)氏菌的侵染使其產(chǎn)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；SBMI組、5%RBI組與ST組小鼠的情況近似，說(shuō)明大豆豆粕和赤小豆中的成分發(fā)揮了一定的作用，減輕了鼠傷寒沙門(mén)氏菌引起的炎癥反應(yīng).IL-10作為抗炎因子，其含量越高則體內(nèi)炎癥越輕，由圖9(c)可以看出其含量趨勢(shì)與前兩個(gè)促炎因子相反.這進(jìn)一步驗(yàn)證了相比于ST飼料，SBM飼料與5%RB飼料更好地緩解了鼠傷寒沙門(mén)氏菌引起的腸道炎癥反應(yīng).此外，從圖9(b)和(c)還可以看出，5%RBI組的TNFα顯著低于SBMI組的，而IL-10濃度顯著高于SBMI組的，說(shuō)明5%RB飼料不僅可以緩解鼠傷寒沙門(mén)氏菌引起的腸炎，還達(dá)到了比SBM飼料更好的效果.

圖9 小鼠血清中炎癥因子的質(zhì)量濃度 Fig.9 Concentration of inflammatory factors in mouse serum

黃酮類(lèi)化合物可以在體內(nèi)外不同程度地抑制腸道炎癥.槲皮素是一種常見(jiàn)的抗氧化劑類(lèi)黃酮，在體外能夠下調(diào)骨髓源性巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)，同時(shí)可以通過(guò)抑制NF-κB通路調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎[41].黃芩純化物可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中NF-κB的激活，發(fā)揮抗炎作用[42].大豆異黃酮可以顯著抑制雌激素受體α和NLRP3炎癥小體的表達(dá)，改善DSS誘導(dǎo)的腸道炎癥[43].根據(jù)以上研究推測(cè)，黃酮類(lèi)化合物在緩解鼠傷寒沙門(mén)氏菌誘導(dǎo)的腸道炎癥中發(fā)揮了重要作用.當(dāng)然，赤小豆飼料對(duì)腸道炎癥的抑制作用也并不能完全歸因于黃酮的存在，一些豆類(lèi)中的其他微量物質(zhì)也可能會(huì)對(duì)腸道炎癥產(chǎn)生影響，例如膳食纖維發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸等[44－46].

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用由鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染小鼠引起的腸道炎癥模型探究了大豆豆粕及赤小豆對(duì)腸道炎癥的影響，通過(guò)測(cè)定飼料成分中的膳食成分和黃酮含量、糞便中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌含量、糞便中的黃酮含量、小鼠血清中炎癥因子的質(zhì)量濃度并對(duì)腸道切片觀察，分析膳食干預(yù)對(duì)小鼠腸道炎癥的改善作用.結(jié)果表明，當(dāng)受到致病菌如鼠傷寒沙門(mén)氏菌侵染時(shí)，豆類(lèi)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和功能成分會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用，削弱致病菌的侵染能力，減輕腸道炎癥等不良影響.赤小豆減弱鼠傷寒沙門(mén)氏菌的侵染作用可能是包括膳食纖維在內(nèi)的多種物質(zhì)復(fù)合作用的結(jié)果，但其中的黃酮發(fā)揮了重要作用，適量攝入黃酮類(lèi)化合物有助于抑制腸道致病菌的侵染.