李鈺 丁文倩 李琳 許家棟 方燕 楊琰 胡小偉 儲(chǔ)利勝

浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

缺血性腦卒中是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，也是成年人致死致殘的主要原因。目前，組織型纖溶酶原激活劑是臨床治療腦缺血的唯一有效藥物，但治療時(shí)間窗狹窄和顱內(nèi)出血的風(fēng)險(xiǎn)限制了其臨床應(yīng)用[1]。研究表明，內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)干細(xì)胞移植可促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)[2-3]，然而腦缺血損傷區(qū)的微環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，限制了其療效[4]。因此，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞存活為腦缺血的治療提供了一個(gè)有效策略。

黃芪是中醫(yī)臨床治療腦缺血的常用中藥，黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷對(duì)腦缺血急性期損傷具有保護(hù)作用[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能促進(jìn)氧糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化[6]，增強(qiáng)腦缺血后神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)功能恢復(fù)[7-8]，還能促進(jìn)移植的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，改善阿爾茨海默病模型大鼠的認(rèn)知能力[9]，但具體機(jī)制尚不完全清楚。微小核糖核酸（microRNA，miR）是一類長(zhǎng)度為19～22個(gè)的核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)不完全或完全互補(bǔ)結(jié)合，抑制mRNA翻譯或使其降解，從而負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)[10]。近年來(lái)研究證實(shí)，miRNA調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等過(guò)程[11-12]。 研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p在腦內(nèi)廣泛表達(dá)[13]，腦和脊髓缺血再灌注損傷后miR-199a-5p表達(dá)減少，miR-199a-5p過(guò)表達(dá)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[14-15]。上述研究提示miR-199a-5p可能介導(dǎo)腦缺血后神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。本研究旨在體外觀察黃芪甲苷是否通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p緩解OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞損傷，為腦缺血后的臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)孕14 d雌性SD大鼠，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2018-0012]。飼養(yǎng)環(huán)境溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 h/12 h明暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。本研究嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：ZSLL-2017-111）。

1.1.2 主要試劑 黃芪甲苷（純度為97.4%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)：110781-201616）；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號(hào)：17011001）；胎牛血清、B-27和表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司（批號(hào)：1527494、1827407、1745454）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司（批號(hào)：1860104）；脂質(zhì)體2000購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司 （批號(hào)：1854316）；Accutase和5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司（批號(hào)：SLBS1935V、HMBD8875V）；綿羊多克隆BrdU抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司（批號(hào)：GR3380504-2）；小鼠單克隆抗體巢蛋白（Nestin）和小鼠單克隆抗體神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司 （批號(hào)：B2515、A2510）；兔多克隆抗體神經(jīng)元特異性核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）購(gòu)于美國(guó)Millipore公司 （批號(hào)：3305071）；兔切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved caspase-3）多克隆抗體和兔caspase-3多克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司（批號(hào)：07、08）；小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 單克隆抗體購(gòu)于杭州華安生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：HO0408）；異硫氰酸熒光素標(biāo)記磷脂結(jié)合蛋白/碘化丙啶（Annexin-fluorescein isothiocyanate isomer/propidium iodide，Annexin Ⅴ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司（批號(hào)：4293719）；Trizol試劑購(gòu)于 德 國(guó) QIAGEN 公 司 （批 號(hào) ：55708000）；Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司（批號(hào)：1701060A、AKA1005）；miR-199a-5p拮抗劑和miR-199a-5p拮抗劑對(duì)照購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司（批號(hào)：1518697130、111439753）。

1.1.3 主要儀器 4111型二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；27310型缺氧小室購(gòu)于美國(guó)Stemcell公司；ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Tech公司；C6型流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；DMIL型倒置熒光顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司；Light-Cycler 96型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Realtime quantitative polymerase chain reaction，Realtime qPCR）儀為美國(guó)Roche公司產(chǎn)品；T100型RNA反轉(zhuǎn)錄儀、PowerPacTMBasic型垂直電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)和FluorChem Q型凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞分離、原代培養(yǎng)與傳代 取14 d胎鼠的大腦皮層，切成1 mm3的組織塊，0.25%胰酶消化15 min，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，以神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%B27+20 ng·mL-1EGF+20 ng·mL-1bFGF+1%青-鏈霉素）重懸，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，前3 d每天換液，待神經(jīng)球形成后，2～3 d換液1次。 1周后傳代，每3 d換液1次，每7～8 d傳代1次，將第3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞鑒定

1.2.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè) 將神經(jīng)干細(xì)胞球經(jīng)Accutase消化成單細(xì)胞懸液，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到0.1 mg·mL-1多聚賴氨酸包被的96孔板，正常貼壁培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4%多聚甲醛固定30 min，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）處理細(xì)胞15 min，10%山羊血清封閉1 h，加小鼠Nestin單克隆抗體 （稀釋比例：1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗（稀釋比例：1∶100）孵育1 h，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復(fù)染，封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，每孔隨機(jī)取3個(gè)不同視野，對(duì)Nestin標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值作為測(cè)量值。

1.2.2.2 神經(jīng)干細(xì)胞增殖特性檢測(cè) 以BrdU/Nestin免疫熒光雙標(biāo)染色檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖特性。將神經(jīng)干細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種于96孔板，在神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μmol·L-1的BrdU培養(yǎng)24 h。以4%多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton X-100破膜15 min，2 mol·L-1氯化氫變性30 min，0.1 mol·L-1硼酸于室溫下中和反應(yīng)10 min，3%過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min，5%驢血清封閉1 h，加入綿羊BrdU多克隆抗體（稀釋比例：1∶200）及鼠Nestin抗體（稀釋比例：1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，加Cy3標(biāo)記驢抗綿羊二抗（稀釋比例：1∶100）和FITC標(biāo)記驢抗鼠二抗（稀釋比例：1∶100），37 ℃避光孵育1 h，DAPI復(fù)染，封片，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，每孔隨機(jī)取3個(gè)不同視野，對(duì)雙標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值作為測(cè)量值。

1.2.2.3 神經(jīng)干細(xì)胞分化能力檢測(cè) 以NeuN、GFAP免疫熒光染色檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的情況。神經(jīng)干細(xì)胞用無(wú)定向分化培養(yǎng)基（DMEM/F12培養(yǎng)基+1%胎牛血清）培養(yǎng)7 d，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%TritonX-100破膜15 min，10%羊血清封閉1 h，加入兔NeuN多克隆抗體（稀釋比例：1∶100）及小鼠GFAP單克隆抗體（稀釋比例：1∶100），4℃避光孵育過(guò)夜后，加入FITC標(biāo)記羊抗兔二抗（稀釋比例：1∶100）和Cy3標(biāo)記羊抗小鼠二抗（稀釋比例：1∶100），37 ℃孵育1 h，DAPI復(fù)染，封片，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，每孔隨機(jī)取3個(gè)不同視野，細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，取平均值作為測(cè)量值。

1.2.3 OGD/R模型的建立 參照文獻(xiàn)[16]中的方法，神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)Accutase消化成單細(xì)胞懸液，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后將DMEM/F12培養(yǎng)基更換為無(wú)糖培養(yǎng)基，并將細(xì)胞置于缺氧小室中，以三元混合氣（94%N2、5%CO2、1%O2）培養(yǎng)8 h，然后更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。正常對(duì)照組采用正常培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)相同時(shí)間。

1.2.4 細(xì)胞分組與干預(yù)措施 除正常對(duì)照組外，將神經(jīng)干細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液后重懸，并按1×106個(gè)/mL的數(shù)量接種于6孔板，分為模型對(duì)照組、黃芪甲苷組、黃芪甲苷+miR-199a-5p拮抗劑組（拮抗劑組）、黃芪甲苷+miR-199a-5p拮抗劑對(duì)照組 （拮抗劑對(duì)照組）。采用脂質(zhì)體2000，將miR-199a-5p拮抗劑及對(duì)照轉(zhuǎn)染到神經(jīng)干細(xì)胞，具體方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1 d，神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)Accutase消化成單細(xì)胞懸液，按1×106個(gè)/mL的數(shù)量接種于6孔板，待細(xì)胞融合到70%～80%時(shí)轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)染前，取4 μL的脂質(zhì)體2000，以96 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋；10 μL拮抗劑或拮抗劑對(duì)照以90 μL的Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，然后將兩者混勻，室溫孵育15 min，將混合液加至不含抗生素的完全培養(yǎng)基中，拮抗劑和拮抗劑對(duì)照轉(zhuǎn)染濃度均為100 nmol·L-1。 將細(xì)胞放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行OGD/R干預(yù)，再灌注時(shí)加入黃芪甲苷處理72 h。

1.2.5 細(xì)胞活性檢測(cè) 采用2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽[2-（2-methoxy-4-nitrophenyl）-3-（4-nitrophenyl）-5-（2，4-disulfonic acid benzene）-2H-tetrazole monosodium salt，CCK-8]法檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)正常神經(jīng)干細(xì)胞活性的影響。神經(jīng)干細(xì)胞以Accutase消化成單細(xì)胞懸液，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種于96孔板中，每孔100 μL。神經(jīng)干細(xì)胞OGD干預(yù)8 h后，分別加入含0、1、10、25、50、100、200 μmol·L-1黃芪甲苷的正常培養(yǎng)基孵育72 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定每孔的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（各組吸光度值-空白孔吸光度值）/（正常對(duì)照組吸光度值-空白孔吸光度值）×100%。每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔。

1.2.6 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞以Accutase消化成單細(xì)胞懸液，并接種于6孔板（數(shù)量為1×106個(gè)/mL）中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。4℃預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌兩次，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，稍混勻后避光孵育15 min，再加入5 μL PI染液避光孵育5 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 Real-time qPCR檢測(cè)miR-199a-5p基因表達(dá)采用Trizol法提取總RNA，按照Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：37℃ 60 min，85℃ 5 s。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.8 免疫印跡法檢測(cè)caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，加入200 μL蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定總蛋白含量。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，恒流轉(zhuǎn)膜2 h，常溫下5%牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）封閉2 h，加入兔caspase-3多克隆抗體（稀釋比例：1∶1 000）、兔cleaved caspase-3多克隆抗體（稀釋比例：1∶1 000）和小鼠GAPDH單克隆抗體（稀釋比例：1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜；洗膜后分別加入羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶IgG和羊抗鼠辣根過(guò)氧化物酶IgG（稀釋比例：1∶5 000），室溫孵育2 h；化學(xué)發(fā)光底物顯色，Bio-Rad成像系統(tǒng)顯影成像，采用Image J軟件分析各條帶的灰度值，結(jié)果用cleaved caspase-3/caspase-3灰度值比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示。多組樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定 神經(jīng)干細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，聚集成球，中心變暗，折光性好。見(jiàn)圖1A。Nestin免疫熒光染色結(jié)果顯示，神經(jīng)干細(xì)胞陽(yáng)性率約為98.41%。見(jiàn)圖1B。神經(jīng)干細(xì)胞增殖檢測(cè)顯示，BrdU/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞百分比約為17.14%。見(jiàn)圖1C。神經(jīng)干細(xì)胞分化檢測(cè)結(jié)果顯示，神經(jīng)干細(xì)胞約19.32%分化為神經(jīng)元（NeuN陽(yáng)性細(xì)胞），約67.83%分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP陽(yáng)性細(xì)胞）。見(jiàn)圖1D。上述結(jié)果提示，所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of neural stem cells in vitro

2.2 黃芪甲苷促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活首先評(píng)價(jià)黃芪甲苷對(duì)正常培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞活性影響。黃芪甲苷處理72 h后，與正常對(duì)照組比較，黃芪甲苷（1～100 μmol·L-1）干預(yù)后神經(jīng)干細(xì)胞活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但200 μmol·L-1黃芪甲苷抑制了神經(jīng)干細(xì)胞活性（P＜0.01）。 見(jiàn)圖2A。

然后觀察黃芪甲苷對(duì)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞活性的影響。神經(jīng)干細(xì)胞OGD/R處理后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組神經(jīng)干細(xì)胞活性下降（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，50 μmol·L-1和100 μmol·L-1黃芪甲苷組 神經(jīng) 干 細(xì)胞 活性 提 高（P＜0.01，P＜0.05），且50 μmol·L-1黃芪甲苷效果最佳，因此選取該濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖2B。

圖2 黃芪甲苷促進(jìn)OGD/R損傷后神經(jīng)干細(xì)胞的存活Fig.2 Astragaloside Ⅳ promotes the survival of neural stem cells after OGD/R injury

2.3 黃芪甲苷抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，黃芪甲苷組（50 μmol·L-1）處理后神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.01）。 見(jiàn)圖3。 結(jié)果提示，黃芪甲苷抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。

圖3 黃芪甲苷抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡Fig.3 Astragaloside Ⅳ inhibits apoptosis of neural stem cells after OGD/R injury

2.4 黃芪甲苷通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活 Real-time qPCR結(jié)果提示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組miR-199a-5p表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，黃芪甲苷組（50 μmol·L-1）處理后miR-199a-5p表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)圖4A。采用脂質(zhì)體2000將miR-199a-5p拮抗劑轉(zhuǎn)染到神經(jīng)干細(xì)胞，Real-time qPCR結(jié)果提示，神經(jīng)干細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)顯著下降約60.53%（P＜0.01）。 見(jiàn)圖4B。

采用CCK-8檢測(cè)黃芪甲苷對(duì)轉(zhuǎn)染后神經(jīng)干細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組神經(jīng)干細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，黃芪甲苷（50 μmol·L-1）處理后神經(jīng)干細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.01）；與黃芪甲苷組比較，拮抗劑組神經(jīng)干細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.01）；拮抗劑對(duì)照組神經(jīng)干細(xì)胞活性與黃芪甲苷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)圖4C。

圖4 黃芪甲苷通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活Fig.4 Astragaloside Ⅳ promotes the survival of neural stem cells by up-regulating miR-199a-5p after OGD/R injury

2.5 黃芪甲苷通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，黃芪甲苷（50 μmol·L-1） 處理后神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.01）；與黃芪甲苷組比較，拮抗劑組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.01）；拮抗劑對(duì)照組神經(jīng)干細(xì)胞凋亡率與黃芪甲苷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 黃芪甲苷通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡Fig.5 Astragaloside Ⅳ inhibits apoptosis of neural stem cells by up-regulating miR-199a-5p after OGD/R injury

2.6 黃芪甲苷下調(diào)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá) 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組間caspase-3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組神經(jīng)干細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，黃芪甲苷（50 μmol·L-1）處理后神經(jīng)干細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01）；與黃芪甲苷組比較，拮抗劑組神經(jīng)干細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；拮抗劑對(duì)照組神經(jīng)干細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)與黃芪甲苷組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)圖6。

圖6 黃芪甲苷下調(diào)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)Fig.6 Astragaloside Ⅳ reduces cleaved caspase-3 protein expression in neural stem cells after OGD/R injury

3 討論

內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)干細(xì)胞移植能夠促進(jìn)腦缺血損傷修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)，但損傷局部微環(huán)境導(dǎo)致大量神經(jīng)干細(xì)胞死亡限制其療效[4]。近年來(lái)研究證實(shí)，藥物干預(yù)可以促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活，減少其凋亡，如阿伐他汀、黃芪多糖、人參皂苷Rg1和白藜蘆醇能夠促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞的存活，抑制其凋亡[16-19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠抑制OGD/R損傷的心肌細(xì)胞、PC12細(xì)胞和神經(jīng)元凋亡[20-23]。另有研究報(bào)道，黃芪甲苷能夠促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化和整體腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生[6-8]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，黃芪甲苷促進(jìn)體外OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活，抑制其凋亡。

miRNA參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡、分化和遷移等過(guò)程[11-12]。caspase-3是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶caspase家族成員，在凋亡程序的執(zhí)行中起核心作用[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，腦和脊髓缺血再灌注損傷后miR-199a-5p表達(dá)顯著減少，上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)顯著減少神經(jīng)元凋亡[14-15]。低氧抑制心肌細(xì)胞表達(dá)miR-199a，過(guò)表達(dá)miR-199a則能夠減少低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，抑制caspase-3、caspase-6、caspase-9和caspase-12表達(dá)[26]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)miR-199a-5p，抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減少cleaved caspase-3表達(dá)[27]。內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)miR-199a-5p抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[28]。上述結(jié)果表明，miR-199a-5p抑制缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷通過(guò)下調(diào)miR-23a和miR-92a抑制cleaved-caspase-3表達(dá)，減少低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[23]；還可通過(guò)抑制miR-124下調(diào)cleaved caspase-3表達(dá)，減少低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R處理的神經(jīng)干細(xì)胞miR-199a-5p表達(dá)下降，黃芪甲苷上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞存活、抑制凋亡。轉(zhuǎn)染miR-199a-5p拮抗劑后，黃芪甲苷的保護(hù)效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，黃芪甲苷通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活，抑制其凋亡。

本研究采用體外OGD/R模型模擬整體腦缺血再灌注損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OGD/R抑制神經(jīng)干細(xì)胞存活，促進(jìn)其凋亡，減少miR-199a-5p表達(dá)；黃芪甲苷促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活，抑制其凋亡，并能上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)，下調(diào)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，而miR-199a-5p拮抗劑則逆轉(zhuǎn)黃芪甲苷的保護(hù)作用。上述結(jié)果表明，黃芪甲苷通過(guò)上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞損傷。

綜上所述，本研究證實(shí)黃芪甲苷促進(jìn)OGD/R損傷的神經(jīng)干細(xì)胞存活、抑制神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能與其上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)，抑制cleaved caspase-3表達(dá)有關(guān)。但黃芪甲苷上調(diào)miR-199a-5p表達(dá)保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞缺血再灌注損傷的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。