羅亞燦，吳鎮(zhèn)杰，金敏莉，樓樂靜，楊松，蔡濟(jì)豪，蔡暢

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州 325015；2.臺(tái)州醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 臺(tái)州 317000

氣道重塑是哮喘的主要病理特征之一，是導(dǎo)致患者不可逆性肺功能下降的主要原因，與哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)[1]。研究證實(shí)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition, EMT）是氣道重塑的重要機(jī)制之一[2]。

脂氧素A4（lipoxinA4, LXA4）是重要的內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)[3]。臨床研究顯示，重度哮喘患者體液中LXA4水平明顯降低，并與肺功能下降程度存在正相關(guān)性[4]。LXA4可在體外抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的人肺成纖維細(xì)胞增殖[5]和膠原分泌[6]。15-epi-LXA4可以逆轉(zhuǎn)博來霉素引起的肺纖維化[7]。成纖維細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等與氣道重塑改變相關(guān)的細(xì)胞均普遍表達(dá)LX受體[5，8]。小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)LXA4可以同時(shí)減輕哮喘小鼠的過敏性氣道炎癥和氣道重塑[9]，而在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，上皮細(xì)胞中LX受體和LX的表達(dá)增加有助于受損氣道上皮的修復(fù)[8]。這些證據(jù)均提示LXA4在氣道重塑中發(fā)揮著重要作用。本研究探討LXA4對(duì)人正常支氣管上皮細(xì)胞EMT和卵清蛋白（ovalbumin, OVA）誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道重塑的影響以及相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 BEAS-2B細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心（AmericanTypeCultureCollection, ATCC）；6～8周齡BALB/c雄性小鼠32只，體質(zhì)量18～22g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK（滬）2012-0002]，動(dòng)物飼養(yǎng)在無特定病原體的條件下，室溫維持在21～23℃，濕度保持40%～60%，12h/12h自然光照交替。LXA4購(gòu)自美國(guó)CaymanChemical公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ERK1/2、pERK1/2 抗體購(gòu)自美國(guó)CellSignalTechnology公司；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；SYBRGreenreal-timePCRMasterMix、反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara公司；所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組和處理：將小鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、OVA組、LXA4組和OVA+LXA4組，每組8只。OVA誘導(dǎo)建立哮喘小鼠模型：在第1天和第14天，給小鼠腹腔注射0.2mL含有20μgOVA和200μL1.36%氫氧化鋁的0.9%氯化鈉溶液以誘導(dǎo)過敏；從第24天開始，小鼠霧化吸入含2mg/mLOVA的0.9%氯化鈉溶液處理30min，持續(xù)3d（對(duì)照組和LXA4組小鼠予以等量的0.9%氯化鈉溶液）。OVA+LXA4組和LXA4組每次霧化處理前半小時(shí)尾靜脈注射100μg/kgLXA4，對(duì)照組、OVA組注射等量0.9%氯化鈉溶液。收集小鼠肺左葉，4%多聚甲醛浸泡固定，石蠟包埋切片。

1.2.2 HE和PAS染色：收集的小鼠肺組織石蠟包埋切片進(jìn)行HE和PAS染色，觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：正常肺氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B在含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃，含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中。BEAS-2B細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞匯集至70%～80%時(shí)，按1:4傳代。細(xì)胞分為6組：對(duì)照組、IL-4組（20ng/mLIL-4）、IL-13組（20ng/mLIL-13）、TGF-β1組（20ng/mLTGF-β1）、IL-4/IL- 13/TGF-β1 聯(lián)合刺激組（IL-4、IL-13 和TGF-β1 各20ng/mL）、LXA4預(yù)處理組（在添加IL-4、IL-13和TGF-β1前用200ng/mLLXA4預(yù)處理30min）。Beas-2B傳代24h后更換為1%胎牛血清培養(yǎng)基，按上述分組予以不同處理，72h后收集細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（r e a l-tim equantitativepolymerasechainreaction, RTqPCR）：根據(jù)試劑盒說明，使用RNAisoplus提取各組細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度和純度。使用PrimeScriptTMRTMasterMix將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR?PremixExTaqTM通過實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行定量。相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平通過2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1，RPLP0用作內(nèi)參。

表1 引物序列

1.2.5 Westernblot：從細(xì)胞中分離蛋白質(zhì)，并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)樣品加載到10%SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，膜用5.0%牛奶室溫封閉2h，然后與2%BSA稀釋的一抗4℃孵育過夜，抗體濃度分別為：兔抗E-cadherin抗體、兔抗ERK1/2抗體和兔抗pERK1/2抗體1:1000，兔抗α-SMA抗體1:5000，鼠抗GAPDH抗體1:500。PBST洗膜3 次后，將膜與相應(yīng)二抗室溫下孵育1h。使用ECL試劑盒對(duì)條帶進(jìn)行可視化，使用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度值定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示。各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LXA4對(duì)OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘氣道重塑的作用 HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組、LXA4組小鼠的肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，無水腫，肺實(shí)質(zhì)未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；OVA組小鼠表現(xiàn)為明顯的肺泡間隔增厚甚至肺泡結(jié)構(gòu)破壞、水腫，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織還可見出血。PAS染色顯示：對(duì)照組和LXA4組未見明顯氣道上皮杯狀細(xì)胞化生；OVA組支氣管上皮組織中存在PAS強(qiáng)陽性染色區(qū)域，提示杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌增加。LXA4干預(yù)能明顯改善OVA誘導(dǎo)的肺泡結(jié)構(gòu)破壞和黏液產(chǎn)生。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE和PAS染色圖

圖2 各組細(xì)胞形態(tài)改變

2.2 IL-4、IL-13對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B發(fā)生EMT的作用 如圖2所示：與對(duì)照組相比，單獨(dú)使用IL-4 或IL-13 刺激的BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，TGF-β1組細(xì)胞連接變得松散，細(xì)胞間隙增加，呈長(zhǎng)梭形；IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激后細(xì)胞形態(tài)較TGF-β1組梭狀更為明顯，細(xì)胞連接更松散，細(xì)胞間隙更寬。RT-qPCR和Westernblot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，單獨(dú)使用IL-4 或IL-13 刺激時(shí)，BEAS-2B細(xì)胞α-SMA、E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)均無明顯改變（P＞0.05）；TGF-β1組細(xì)胞E-cadherinmRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激組較TGF-β1組兩種標(biāo)志物的改變更為明顯（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。2.3 IL-4、IL-13、TGF-β1對(duì)氣道上皮細(xì)胞中ERK1/2MAPK通路的影響 Westernblot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，單獨(dú)使用IL-4、IL-13 后細(xì)胞ERK1/2 蛋白磷酸化水平未見明顯變化（P＞0.05），TGF-β1組ERK1/2 蛋白磷酸化水平升高（P＜0.01），IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激后BEAS-2B細(xì)胞中pERK1/2表達(dá)較單獨(dú)使用TGF-β1增加更為明顯（P＜0.05）。見圖4。2.4 LXA4通過ERK1/2通路調(diào)控氣道上皮細(xì)胞Beas-2BEMT 與IL-4/IL-13/TGF-β1 聯(lián)合刺激組相比，LXA4預(yù)處理后細(xì)胞間隙明顯變窄，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)橢圓形，僅少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為梭形（見圖5）。RT-qPCR和Westernblot結(jié)果顯示，LXA4能夠顯著抑制IL-4、IL-13和TGF-β1聯(lián)合刺激誘導(dǎo)的α-SMA和E-cadherinmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)改變（P＜0.01，P＜0.001）；明顯下調(diào)IL-4、IL-13和TGF-β1聯(lián)合刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)pERK1/2表達(dá)增加（P＜0.01）。見圖6。

3 討論

哮喘氣道重塑包括氣道上皮完整性破壞、上皮下纖維化、杯狀細(xì)胞增生、平滑肌增生肥大和血管增生[10]。本研究通過小鼠模型證實(shí)，LXA4能明顯改善OVA誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞化生、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡壁水腫以及肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等氣道改變，這與之前的研究[9]結(jié)果一致，但LXA4對(duì)參與氣道重塑的結(jié)構(gòu)細(xì)胞的影響尚未明確。

圖3 各組細(xì)胞E-cadherin和α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)水平的 比較

圖5 各組BEAS-2B細(xì)胞的形態(tài)

研究表明，氣道上皮細(xì)胞功能的完整性可能與氣道重塑密切相關(guān)，抑制哮喘小鼠氣道上皮異?；罨梢杂行Ь徑庀瓪獾姥装Y和氣道重塑[11]。氣道上皮細(xì)胞EMT是氣道重塑的重要機(jī)制之一。暴露于過敏原的小鼠氣道上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生EMT并分化成肌成纖維細(xì)胞，引起上皮下纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致氣道壁增厚[12]。E-cadherin是上皮細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一，其表達(dá)下降可能破壞細(xì)胞與細(xì)胞的連接，增加細(xì)胞對(duì)損傷的易感性[13]。E-cadherin水平下調(diào)、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA水平上升被視為EMT的重要表現(xiàn)之一[14]。TGF-β1是公認(rèn)的促纖維化細(xì)胞因子[15-16]，常被用作EMT誘導(dǎo)劑。ZUO等[17]將氣道上皮細(xì)胞暴露在TGF-β1后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，E-cadherin表達(dá)下降。本研究使用TGF-β1誘導(dǎo)BEAS-2B建立EMT模型，TGF-β1刺激BEAS-2B細(xì)胞72h，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，從緊密連接的橢圓形上皮細(xì)胞向連接松散的長(zhǎng)梭形間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，同時(shí)，與對(duì)照組相比，TGF-β1處理后E-cadherin表達(dá)顯著降低，而α-SMA表達(dá)明顯升高。

環(huán)境中的過敏原容易透過損傷的上皮屏障，激活嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致Th1/Th2功能失衡。Th1/Th2失衡在哮喘氣道重塑中起重要作用。IL-4 和IL-13 是重要的具有代表性的Th2源性細(xì)胞因子，能作用于氣道上皮，誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞化生和黏液分泌，參與哮喘氣道上皮重塑[18-19]。本研究結(jié)果顯示，IL-4和IL-13 能顯著增強(qiáng)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT形態(tài)改變，抑制E-cadherin表達(dá)和誘導(dǎo)α-SMA表達(dá)的效力。以上結(jié)果可能提示Th2細(xì)胞因子失衡的氣道微環(huán)境能促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的EMT過程。

ERK1/2磷酸化可激活各種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡。給予慢性哮喘大鼠ERK1/2 的激動(dòng)劑能促進(jìn)小鼠體內(nèi)氣道平滑肌細(xì)胞增殖[20]。ERK信號(hào)通路參與介導(dǎo)IL-13誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞杯狀細(xì)胞增生[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B發(fā)生EMT時(shí)，細(xì)胞內(nèi)pERK1/2蛋白表達(dá)增加。之前在胰腺[22]、腎小管上皮細(xì)胞[23]、肝臟[24]等的研究也顯示組織器官發(fā)生EMT時(shí)ERK1/2MAPK磷酸化激活增加。因此我們推測(cè)，ERK1/2MAPK信號(hào)的激活可能同樣參與調(diào)控氣道上皮細(xì)胞EMT。

本課題組前期研究證實(shí)，LX與哮喘緩解密切相關(guān)[25-26]。研究表明：LXA4通過抑制子宮內(nèi)膜EMT來干擾胚胎植入[27]。LXA4的類似物BML-111能減緩肝癌細(xì)胞的EMT和轉(zhuǎn)移[28]。LXA4可以通過抑制ERK1/2MAPK通路的激活顯著減輕腎臟的損傷[29]、減弱胰腺癌的細(xì)胞侵襲[30]。在本研究中，LXA4能顯著抑制IL-4/IL-13/TGF-β1聯(lián)合刺激誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)下降和α-SMA表達(dá)增加，同時(shí)，LXA4預(yù)處理組與IL-4/IL-13/TGF-β1 聯(lián)合刺激組相比，pERK1/2MAPK蛋白表達(dá)下降，說明LXA4能在一定程度上抑制氣道上皮細(xì)胞EMT，而這種作用可能與ERK1/2磷酸化相關(guān)。

綜上所述，本研究以氣道上皮細(xì)胞為切入點(diǎn)，用IL-4 及IL-13 模擬重癥哮喘患者氣道上皮細(xì)胞所處的Th2細(xì)胞因子失衡的內(nèi)環(huán)境，發(fā)現(xiàn)Th2偏轉(zhuǎn)氣道微環(huán)境能促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞EMT；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)LXA4能改善OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型的氣道重塑，并能在體外減輕氣道上皮細(xì)胞的EMT，這一過程可能與抑制ERK1/2MAPK通路磷酸化相關(guān)。