王婷，蔡雪黎，李海燕，黃周青，王永華

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)科，浙江 溫州 325015；3.溫州醫(yī)科大學(xué)體育部，浙江 溫州 325035

糖尿病導(dǎo)致的糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy, DCM）是獨立于高血壓、冠心病的特異性心肌病，主要病理表現(xiàn)為心肌肥大、間質(zhì)和血管外周纖維化及心肌細(xì)胞壞死，最終發(fā)展為充血性心力衰竭[1]。研究發(fā)現(xiàn)，運動療法在一定程度上通過不同機制（如抗炎、減少凋亡或調(diào)控自噬水平）緩解慢性疾病如高血壓、DCM以及某些腫瘤的進(jìn)展[2-4]。有文獻(xiàn)報道，運動干預(yù)可以降低心血管疾病的病死率[5]。美國糖尿病學(xué)會也倡導(dǎo)運動作為一種重要的非藥物干預(yù)方式，用于改善糖尿病心臟病并發(fā)癥。WNK激酶2（withnolysinekinases2, WNK2）是一種胞質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶[6]，主要表達(dá)于腦、心肌、小腸和結(jié)腸[7-8]，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、腫瘤生長和侵襲[9]；WNK2表達(dá)的缺失也與延緩衰老有關(guān)[10]。本研究通過對db/db糖尿病小鼠進(jìn)行10周的跑臺運動干預(yù)，探討WNK2在運動保護(hù)DCM中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和細(xì)胞

1.1.1 實驗動物：20只8周齡雄性db/db小鼠，20只C57BL/6小鼠購自南京模式動物研究所，于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗動物房分籠飼養(yǎng)。實驗期間自由進(jìn)食和飲水，所有小鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)在12h:12h光-暗交替循環(huán)的恒定室溫環(huán)境中。本研究采取的實驗方案已由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（wydw2016-0266），動物許可證號：SYXK（浙）2021-0017。

1.1.2 細(xì)胞：大鼠心肌細(xì)胞系H9C2購自上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所。在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中使用低糖完全培養(yǎng)基（DMEM1g/L）（含10%胎牛血清和1%青、鏈酶素混合液）培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 主要設(shè)備與試劑 血糖儀（艾科）購自杭州艾康生物技術(shù)有限公司，ZS-PT小動物實驗跑臺購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)（Vevo3100）購自加拿大FujifilmVisualSonics公司。GAPDH（#2881S）抗體購自美國CellSignalingTechnology公司，轉(zhuǎn)化生長因子β（transforminggrowthfactor-β, TGF-β）（ER31210）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase9, MMP9）（ER1706-40）、肌球蛋白重鏈（myosinheavychain, MyHC）（ET1702-88）抗體購自杭州華安生物公司。I型重組人膠原蛋白（collagen-I, COL-I）（sc293182）和心房鈉尿肽（atrialnatriureticpeptide, ANP）（sc-515701）均購自美國SantaCruzBiotechnology公司。WNK2（MBS252985）購自美國MyBioSource公司。葡萄糖和鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司。WNK2激酶抑制劑（WNKkinaseinhibitor, WNK463）（HY-100626）購自美國MedChemExpress公司。

1.3 實驗分組

1.3.1 動物分組：在實驗進(jìn)行前，所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，db/db小鼠隨機分成2組：db/db糖尿病組（db/db組），db/db糖尿病+運動組（db/db+EX組），每組10只。C57BL/6小鼠同樣分2組，分別為空白對照組（WT組），單純運動組（EX組）。

1.3.2 細(xì)胞分組：實驗細(xì)胞分為4組，分別為：對照組（CTRL組）、高糖模型組（HG組）、WNK463和高糖處理組（HG+WNK463組）、WMK463處理組（WNK463組）。將H9C2細(xì)胞以每孔1×106個接種在六孔板或33mm培養(yǎng)皿中，WNK2抑制劑WNK463以1μmol/L的濃度預(yù)處理細(xì)胞1h，在高糖刺激H9C2細(xì)胞模型中，葡萄糖的濃度為33mmol/L，處理24h后收取樣本用BCA法測定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）實驗或免疫熒光。

1.4 實驗運動方案

1.4.1 運動方式：采用電動動物跑臺，參考FERNANDO等[11]的研究，制定小鼠的運動強度和時間，跑臺自動記錄小鼠的運動速度、運動時間和距離。

1.4.2 運動計劃：適應(yīng)性訓(xùn)練1周：坡度0°，速度8m/min，持續(xù)時間20min，運動頻率1次/d，5d/周。正式訓(xùn)練10周：db/db+EX組和EX組：動物跑臺坡度0°，速度10m/min，持續(xù)時間60min，運動頻率1次/d，5d/周。db/db組和WT組：將小鼠置于跑臺的跑道上，但不開啟跑臺，跑道不轉(zhuǎn)動。

1.5 超聲心動圖 小鼠處死前1d采用經(jīng)胸二維超聲心動圖對其進(jìn)行心功能測量。檢測過程中異氟烷麻醉，除去心前區(qū)毛發(fā)，控制心率穩(wěn)定在400～500次/min，使用高分辨率小動物超聲影像系統(tǒng)進(jìn)行超聲心動掃描術(shù)。采集M型和短軸圖像，記錄波形及相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.6 動物取材 跑臺末次運動訓(xùn)練結(jié)束后24h處死，取血清和心臟組織。取材前禁食不禁水12h。眼眶取血，分離血清，用于生化指標(biāo)檢測；取心肌組織，進(jìn)行石蠟包埋和置于液氮中凍存。用于蘇木素伊紅染色（hematoxylin-eosinstaining, HE）、馬松三色（Masson）染色、麥胚凝集素（wheatgermagglutinin, WGA）染色、Westernblot和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-timequantitativepolymerasechainreaction, RT-qPCR）檢測。

1.7 HE染色、Masson染色和WGA-AF488染色 將石蠟切片置于60℃的烘箱里烘片2h，二甲苯脫蠟，經(jīng)由高到低濃度乙醇脫水。依次用蘇木素染液、伊紅染液對組織進(jìn)行HE染色，按照Masson染色液依次用Weigert鐵蘇木素染色液、麗春紅品紅和苯胺藍(lán)染色，以及用WGA染液避光染色，封片后在顯微鏡下觀察、拍照。Masson染色分析為計算膠原容積分?jǐn)?shù)，即膠原陽性的藍(lán)色面積百分比。

1.8 羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色 將適量H9C2細(xì)胞均勻地接種于熒光小皿中，經(jīng)WNK463和葡萄糖處理后，棄去培養(yǎng)皿中細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS漂洗，用4%的多聚甲醛固定10min，0.5%TritonX-100透化處理5min，用80～200nmol/L的TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液室溫避光孵育30min，細(xì)胞在PBS中洗滌3次后，使用DAPI溶液對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，然后用抗熒光淬滅劑封片并在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察。

1.9 免疫組化 石蠟切片脫蠟后加0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH=6.0），放入高壓鍋加熱至95℃，加壓加熱2min（從冒氣開始計時），壓力降至0后取出，自然冷卻后PBS漂洗，使用3%雙氧水（用80%甲醇稀釋）阻斷，室溫靜置10min，用PBS洗3次，滴加適量一抗（WNK2，1:100稀釋），室溫孵育60min，棄去一抗，漂洗后滴加適量二抗（1:100稀釋），室溫孵育60min，棄去漂洗，加入新鮮配置的DAB顯色液（在顯微鏡下觀察，根據(jù)染色程度選擇適當(dāng)時間），最后脫水封片。

1.10 Westernblot檢測 用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）分別提取心肌組織蛋白樣本和H9C2細(xì)胞蛋白樣本。對樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉與膜在室溫緩慢搖蕩1～2h孵育，進(jìn)行膜封閉，然后TBST洗滌。用1%的BSA稀釋的抗體孵育，4℃冰箱過夜。TBST洗滌后二抗室溫孵育2h。隨后ECL顯影、曝光。ImageJ11.0軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白的相對表達(dá)量。

1.11 動物組織總RNA的提取與RT-qPCR 剪碎動物組織，然后使用TRIzol、氯仿抽提RNA，再經(jīng)過異丙醇沉淀，無水乙醇洗滌，晾干，最后視沉淀量加入10～20μLDEPC水溶解RNA。測定RNA的濃度和純度。配制反轉(zhuǎn)錄體系和RT-qPCR反應(yīng)體系，引物由上海生工生物工程有限公司合成，COL-I上游引物：5’-TGGCCTTGGAGGAAACTTTG-3’，下游引物：5’-CTTGGAAACCTTGTGGACCAG-3’；TGF-β上游引物：5’-TGACGTCACTGGAGTTGTACGG-3’，下游引物：5’-GGTTCATGTCATGGATGGTGC-3’；β-actin上游引物：5’-TGGCCTTGGAGGAAACTTTG-3’，下游引物：5’-CTTGGAAACCTTGTGGACCAG- 3’；MyHC上游引物：5’-CAAAGGCAAGGCAAAGAAAG-3’，下游引物：5’-TCACCCCTGGAGACTTTGTC-3’；ANP上游引物：5’-AAGAACCTGCTAGACCACCTGGAG-3’，下游引物：5’-TGCTTCCTCAGTCTGCTCACTCAG-3’；MMP9上游引物：5’-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3’，下游引物：5’-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3’。用2-ΔΔCT法計算上述RNA的相對表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用±s表示，多組間比較采用雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 10周跑臺運動改善小鼠心臟功能障礙 與WT組相比，db/db組小鼠心肌增厚，心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比降低，左心室縮短分?jǐn)?shù)降低，而db/db+EX組的射血分?jǐn)?shù)和左心室縮短分?jǐn)?shù)及心臟質(zhì)量/體質(zhì)量高于db/db組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與WT組相比，db/db組血糖明顯升高，db/db+EX組血糖較db/db組下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。這表明糖尿病小鼠心臟收縮能力明顯下降，而運動減輕了糖尿病小鼠心肌肥厚，改善了心臟功能紊亂，并且主要不是通過改善血糖實現(xiàn)的。

圖1 4組小鼠的心超、血糖、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量、射血分?jǐn)?shù)、左心室縮短分?jǐn)?shù)比較

圖2 小鼠心肌組織免疫組化結(jié)果

圖3 小鼠心肌肥大和纖維化相關(guān)的蛋白和mRNA的表達(dá)

2.2 跑臺運動緩解小鼠心臟纖維化、肥大 心臟HE染色結(jié)果顯示，與WT組相比，db/db組小鼠心肌組織肌纖維排列顯著紊亂，EX組心肌組織無顯著變化，而db/db+EX組小鼠這一現(xiàn)象得到顯著改善。Masson染色結(jié)果顯示，db/db組小鼠心肌表現(xiàn)出明顯的膠原組織和纖維組織的沉積，而db/db+EX組小鼠纖維化堆積的情況得到明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。心肌組織WGA染色結(jié)果顯示，與db/db組相比，db/db+EX組小鼠的心肌細(xì)胞肥大得到了改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。Westernblot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT組相比，db/db組小鼠心肌組織中心肌肥大指標(biāo)（ANP和MyHC）和纖維化指標(biāo)（TGF-β、COL-I和MMP9）表達(dá)量顯著升高；而與db/db組相比，db/db+EX組這些蛋白表達(dá)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；見圖3A-F。RT-qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與WT組相比，db/db組小鼠心肌組織中心肌肥大指標(biāo)（ANP和MyHC）和纖維化指標(biāo)（TGF-β、COL-I和MMP9）mRNA表達(dá)量顯著上升；而與db/db組相比，db/db+EX組以上蛋白的mRNA水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；見圖3GK。

2.3 跑臺運動顯著抑制了心臟組織WNK2 的表達(dá)心臟免疫組化結(jié)果表明，與WT組相比，EX組心肌組織的WNK2表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），db/db組小鼠心肌組織的WNK2表達(dá)顯著增加，而經(jīng)10周運動后心肌組織的WNK2表達(dá)量顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；心肌組織的Westernblot和RT-qPCR檢測結(jié)果表明，WNK2蛋白和mRNA的相對表達(dá)量亦發(fā)現(xiàn)同樣的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示運動干預(yù)顯著抑制了心肌WNK2的表達(dá)。見圖4。

2.4 抑制WNK2可以緩解高糖誘導(dǎo)的H9C2肥大和纖維化 為進(jìn)一步驗證WNK2對高糖誘導(dǎo)的心肌纖維化和肥大的影響，我們利用WNK463預(yù)處理H9C2心肌細(xì)胞系。WNK2表達(dá)在高糖刺激的H9C2細(xì)胞中以時間依賴性方式增加，6h組的細(xì)胞與CTRL組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并在24h趨于平穩(wěn)，見圖5A，所以我們選擇24h作為刺激時間來進(jìn)行接下來的實驗。用不同濃度的WNK463預(yù)處理細(xì)胞，細(xì)胞活力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5D。WNK463抑制WNK2的效率隨濃度的上升而增加，呈濃度依賴性，與CRTL組相比，5μmol/L組細(xì)胞WNK2表達(dá)降低明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5B，且不影響細(xì)胞活力，所以我們選擇5μmol/L的作為處理濃度進(jìn)行實驗。在H9C2細(xì)胞系中，我們發(fā)現(xiàn)與CTRL組相比，HG組的細(xì)胞WNK2表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與HG組相比，HG+WNK463組的細(xì)胞WNK2表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5C。

圖4 小鼠心臟組織的WNK2免疫組化、蛋白和mRNA相對表達(dá)量

羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果表明，WNK463預(yù)處理明顯減輕了高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞肥大，與CTRL組相比，HG組細(xì)胞體積相對值增加，HG+WNK463組的細(xì)胞較HG組體積相對值減小，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖6A、圖6B。Westernblot檢測結(jié)果表明，與CTRL組相比，HG組的細(xì)胞中心肌肥大指標(biāo)（MyHC和ANP）和纖維化指標(biāo)（MMP9、COL-I和TGF-β）表達(dá)顯著上調(diào)，而HG+WNK463組的細(xì)胞較HG組表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6C-I。因此，我們認(rèn)為抑制WNK2可以緩解高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞系肥大和纖維化。

3 討論

圖5 高糖刺激下和使用WNK2抑制劑WNK463處理下的H9C2細(xì)胞系WNK2的蛋白表達(dá)量

圖6 WNK463預(yù)處理后高糖刺激下H9C2細(xì)胞的免疫熒光染色和肥大、纖維化指標(biāo)的表達(dá)

糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性代謝性疾病，可因細(xì)胞外基質(zhì)膠原分泌和降解失調(diào)，導(dǎo)致膠原過度沉積，心肌成纖維細(xì)胞增殖，室壁僵硬和順應(yīng)性下降等，導(dǎo)致左心室重構(gòu)甚至收縮功能障礙[12-13]，其涉及的病理生理機制復(fù)雜繁多，如心臟脂毒性、高血糖等導(dǎo)致心肌細(xì)胞代謝紊亂；TGF-β作為介導(dǎo)纖維化相關(guān)信號通路的重要因子，可促進(jìn)I型膠原和III型膠原蛋白的表達(dá)，構(gòu)成了心肌纖維化的主要病理基礎(chǔ)，在DCM心肌纖維化中扮演重要角色[14-15]；此外，MMP調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解。據(jù)報道，糖尿病大鼠心肌中MMP2/MMP9和COL-I的表達(dá)量明顯增加，促進(jìn)心臟膠原過剩，導(dǎo)致心肌基質(zhì)膠原沉積和功能障礙明顯[16]。同樣地，我們發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，db/db小鼠心臟組織TGF-β、MMP9及COL-I明顯增加，且HE和Masson染色顯示心肌纖維排列顯著紊亂，藍(lán)色纖維組織明顯，這些均提示db/db小鼠心臟纖維化。因此預(yù)防心肌纖維化、緩解心臟重構(gòu)所致的心功能障礙一直是學(xué)者們研究的一個挑戰(zhàn)。

研究表明，慢性規(guī)律的運動訓(xùn)練（每周300min的跑臺）能平衡肥胖大鼠的腎素血管緊張素系統(tǒng)，減少炎癥因子和骨骼肌的AT1受體的表達(dá)[17]，降低由于高齡造成的心肌細(xì)胞纖維化和糖基化終產(chǎn)物的堆積[18]，且運動訓(xùn)練可通過增加胰島素敏感性，改善機體心肌代謝，維持細(xì)胞內(nèi)線粒體功能等機制，改善心肌纖維化[19]。LEW等[20]研究指出運動訓(xùn)練改善了糖尿病小鼠冠狀動脈功能障礙，緩解心功能障礙，尤其在心功能不全早期中高強度的運動獲益多，且這獲益與上調(diào)miR126有關(guān)，而獨立于降血糖的作用。另外，指南指出糖尿病患者建議每周進(jìn)行不少于150min的中等至高強度訓(xùn)練，頻率至少為每周3d[21]，可見，運動訓(xùn)練是干預(yù)2型糖尿病及其并發(fā)癥的有效防治措施。本研究發(fā)現(xiàn)，db/db小鼠經(jīng)過10周的跑臺運動，有效抑制了糖尿病導(dǎo)致的心臟纖維化蛋白TGF-β、MMP9及COL-I的表達(dá)，改善了心肌排列紊亂，減少心臟的纖維組織，這些研究結(jié)果提示對于2型糖尿病患者而言，規(guī)律的有氧運動能有效緩解心肌纖維化，改善心室的重構(gòu)。

WNK2是一種胞質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶，屬于蛋白激酶超家族成員。WNK在細(xì)胞周期調(diào)控、抗凋亡及腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[22]。已經(jīng)明確的是，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤和胰管腺癌等腫瘤中WNK2表達(dá)顯著下調(diào)[6，23-25]，WNK2的失活與腫瘤的早期復(fù)發(fā)相關(guān)；此外，WNK2作為氯離子共轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)哺乳動物大腦細(xì)胞體積[8]。然而，WNK2在DCM中的表達(dá)情況以及所扮演的作用鮮見報道。在本研究中，我們利用db/db糖尿病小鼠及高糖刺激的H9C2細(xì)胞模型，觀察到在高糖狀態(tài)下的心肌細(xì)胞與小鼠心肌組織中WNK2的表達(dá)顯著增加，且WNK2抑制劑處理有效減少TGF-β、MMP9及COL-I表達(dá)，同時抑制了心肌的肥大，提示在DCM中，WNK2上調(diào)與心臟的肥大、纖維化相關(guān)。值得注意的是，我們在糖尿病小鼠中發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運動訓(xùn)練明顯減少WNK2的表達(dá)，這佐證了運動干預(yù)改善DCM的部分機制，至少一部分是通過調(diào)控心肌WNK2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，規(guī)律運動訓(xùn)練通過抑制心肌WNK2的表達(dá)來緩解心肌肥大及纖維化，進(jìn)而抑制心室重構(gòu)發(fā)揮其保護(hù)作用。