婁云云，房慶偉，李 坤，葉 冠

（上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院·上海·201203）

氣虛血瘀證是中醫(yī)里面最常見(jiàn)的證候之一，氣虛則血運(yùn)無(wú)力，血流淤滯，伴隨有自由基積聚、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮損傷、肝腎損傷等，而這些又進(jìn)一步促進(jìn)了血瘀的發(fā)生，危害性極大[1]。人參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根及根莖，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固托之功效，為氣虛體弱之要藥。金洪鍵等[2]研究發(fā)現(xiàn)人參花提取物與同等劑量人參根提取物均能使氣虛血瘀模型大鼠的血液流變性明顯改善，并且沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。目前，人參莖葉和人參花等非藥用部位的資源利用還未引起足夠的重視，而大量研究表明，人參地上部位具有與傳統(tǒng)藥用部位相似的化學(xué)成分和生物學(xué)功能[3]。前期文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于人參莖葉總皂苷對(duì)氣虛血瘀作用的相關(guān)報(bào)道。在本文中，我們研究了園參莖葉總皂苷和林下山參莖葉總皂苷對(duì)氣虛血瘀模型大鼠的治療作用研究，并通過(guò)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，探討其可能的作用機(jī)制。本研究將為后期人參莖葉資源的更好利用提供一定的借鑒依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠80只，雌雄各半，體重約180～220 g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2016-0010。

1.2 藥物

園參莖葉總皂苷（人參莖葉總皂苷含量77.37%，人參皂苷Rg1、Re、Rd含量之和為34.06%），林下參莖葉總皂苷（人參莖葉總皂苷含量77.07%，人參皂苷Rg1、Re、Rd含量之和為37.46%），均為實(shí)驗(yàn)室自制，其制法參考2020版《中國(guó)藥典》[4]。實(shí)驗(yàn)用園參莖葉及林下參莖葉樣品經(jīng)葉冠教授級(jí)高級(jí)工程師鑒定為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥莖葉；鹽酸腎上腺素注射液（哈爾濱三馬獸藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20201002）。

1.3 試劑

肌酸激酶（CK）測(cè)定試劑盒、超微量Na+-K+-ATP酶測(cè)定試劑盒、一氧化氮（NO）測(cè)定試劑盒（購(gòu)于南京建成生物工程研究所）；大鼠肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）ELISA試劑盒、大鼠內(nèi)皮素-1（ET-1）ELISA試劑盒、大鼠血栓素B2（TXB2）ELISA試劑盒（購(gòu)于江蘇雨桐生物科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

BSA 224S電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；YF116B型打粉機(jī)（瑞安永歷制藥機(jī)械）；3K15型高速離心機(jī)（德國(guó)sigma）；MultiskanFC型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo）；全自動(dòng)血液流變測(cè)試儀（北京賽科希德）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

SD大鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分為8組：正常組、模型組、園參莖葉總皂苷低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組（YSD、YSZ、YSG）、林下山參莖葉總皂苷低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組（LXD、LXZ、LXG），每組10只。各給藥組給予相應(yīng)藥物，正常組及模型組給予等量溶媒。各組動(dòng)物每天灌胃給藥1次，給藥體積為10 mL/kg體重。

2.2 模型制備

各給藥組大鼠預(yù)先連續(xù)給藥7天，除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠每日游泳至力竭（以頭沉入水中5～10 s為準(zhǔn)），連續(xù)7天。正常組從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始至結(jié)束正常飲水、喂食。各組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)第7天下午禁食不禁水12 h，第8天上午，除正常組外，其余各組均皮下注射鹽酸腎上腺素注射液（0.1 mL/200 g大鼠）制備氣虛血瘀模型，注射1 h后開(kāi)始取材[5-6]。

2.3 藥物制備

園參莖葉總皂苷組：分別精密稱(chēng)取藥物14、28、56 mg，用100μL DMSO充分溶解，用生理鹽水稀釋至14 mL，分別得到低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組。

林下山參莖葉總皂苷組：同園參莖葉總皂苷配制過(guò)程。

2.4 檢測(cè)方法

采血方法：大鼠經(jīng)1.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉后自腹主動(dòng)脈采血約3.0 mL用于血流變學(xué)檢測(cè)，約2.0 mL用于血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。

血樣處理方法：血流變學(xué)檢測(cè)將血液置于枸櫞酸鈉抗凝管，立即檢測(cè)；血清生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)將不經(jīng)抗凝處理血液3000 r/min離心10 min，取上清液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用t檢驗(yàn)分析法，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，以P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 園參莖葉總皂苷與林下山參莖葉總皂苷對(duì)氣虛血瘀模型大鼠血流變學(xué)的影響

與正常組比較，模型組全血黏度（低切、中切、高切）均有明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，YSD、YSZ、YSG、LXD、LXZ、LXG組全血黏度（低切、中切）均有明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，YSZ、YSG、LXZ、LXG組全血黏度（高切）有明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，YSD、LXD組全血黏度（高切）變化無(wú)明顯差異。詳見(jiàn)表1。

表1 園參莖葉總皂苷與林下山參莖葉總皂苷對(duì)氣虛血瘀模型大鼠血流變學(xué)的影響（n=10,±s）

表1 園參莖葉總皂苷與林下山參莖葉總皂苷對(duì)氣虛血瘀模型大鼠血流變學(xué)的影響（n=10,±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比，△△P＜0.01

組別 全血黏度低切(5 s) 中切(50 s) 高切(200 s)正常組 9.46±0.66** 5.36±0.55** 4.26±0.33**模型組 17.55±1.25△△ 8.45±0.65△△ 5.49±0.48△△YSD 14.51±1.45**△△ 7.01±0.29**△△ 5.21±0.24△△YSZ 14.01±1.58**△△ 6.23±0.62**△△ 5.07±0.36*△△YSG 12.85±1.38**△△ 6.10±0.70**△ 4.86±0.48**△△LXD 15.25±1.61**△△ 6.82±0.33**△△ 5.19±0.28△△LXZ 14.71±1.74**△△ 6.35±0.78**△△ 4.96±0.54*△△LXG 11.76±0.96**△△ 6.11±0.59**△△ 4.72±0.60**△

3.2 園參莖葉總皂苷與林下山參莖葉總皂苷對(duì)氣虛血瘀模型大鼠血清生化指標(biāo)的影響

模型組較正常組各項(xiàng)指標(biāo)均有顯著性差異（P＜0.01）；與模型組比較，YSZ、YSG、LXZ、LXG組6項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度升高或降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，YSD組Na+-K+-ATP酶有所升高（P＜0.01）；與模型組比較，LXD組Na+-K+-ATP酶有所升高（P＜0.05），CK-MB酶有所降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2、3。

表2 園參莖葉總皂苷與林下山參莖葉總皂苷對(duì)CK、CK-MB、Na+-K+-ATP水平的影響（n=10,±s）

表2 園參莖葉總皂苷與林下山參莖葉總皂苷對(duì)CK、CK-MB、Na+-K+-ATP水平的影響（n=10,±s）

注：與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 CK（U/mL） CK-MB（U/L）Na+-K+-ATP（μmol/mg·h）正常組 0.43±0.17** 26.81±5.60** 9.17±1.70**模型組 0.87±0.21△△ 72.56±11.06△△ 3.92±1.09△△YSD 0.69±0.24△ 65.78±9.47△△ 5.81±1.71**△△YSZ 0.60±0.18**△ 59.72±10.24*△△ 6.41±2.30**△△YSG 0.54±0.21** 55.59±8.10**△△ 6.50±1.78**△△LXD 0.71±0.16△△ 60.56±10.63*△△ 5.60±1.93*△△LXZ 0.61±0.27* 58.47±7.82**△△ 7.10±1.67**△LXG 0.49±0.15** 55.50±10.90**△△ 7.28±1.58**△

表3 園參莖葉總皂苷與林下山參莖葉總皂苷對(duì)NO、ET-1、TXB2水平的影響（n=10,±s）

表3 園參莖葉總皂苷與林下山參莖葉總皂苷對(duì)NO、ET-1、TXB2水平的影響（n=10,±s）

注：與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常對(duì)照組比，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 NO（μmol/L） ET-1（ng/L） TXB2（ng/L）正常組 73.46±15.75** 36.63±8.48** 88.56±12.23**模型組 45.04±9.56△△ 130.69±28.07△△ 144.38±34.88△△YSD 48.87±13.70△△ 111.50±19.65△△ 120.25±17.03△△YSZ 56.54±8.96*△ 94.19±11.14**△△ 111.81±18.72*△△YSG 59.02±14.58*△ 81.94±12.87**△△ 100.19±18.87**LXD 49.44±9.10△△ 107.38±21.62△△ 123.31±17.20△△LXZ 56.65±10.30*△ 90.88±16.44**△△ 112.63±32.27*△LXG 61.17±12.78** 75.56±15.30**△△ 107.13±25.24*

4 討論

人參莖葉總皂苷是由人參的干燥莖葉經(jīng)加工制成的皂苷，其中園參莖葉是生產(chǎn)該提取物的主要原料。近年來(lái)，隨著人參莖葉總皂苷需求的不斷增加，導(dǎo)致人參莖葉資源的利用問(wèn)題進(jìn)一步放大。本文以?xún)煞N不同生境的人參莖葉總皂苷為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)不同生境人參莖葉總皂苷對(duì)于氣虛血瘀模型大鼠的改善作用沒(méi)有顯著性差異，這在一定程度上為林下山參莖葉資源的利用提供理論依據(jù)。

血液流變學(xué)的改變是研究氣虛血瘀證的重要指標(biāo)[7-8]。血液黏度的最大特征是隨剪切速率的增加而降低，所以全血黏度就是特定剪切速率下的表觀黏度。全血黏度可分為高切、中切和低切黏度，其中高切黏度是指血流較快時(shí)的血液黏度，主要反映了紅細(xì)胞的變形對(duì)血流的影響，而低切黏度是指血流緩慢時(shí)的血液黏度，主要反映了紅細(xì)胞凝聚對(duì)血流的影響，中切黏度則介于兩者之間。如表1所示，模型組較正常組在高切、中切和低切黏度等各指標(biāo)均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組比較，給藥組可使氣虛血瘀模型大鼠的血液黏度得到不同程度的改善。

CK是一種與ATP再生、肌肉收縮、細(xì)胞能量轉(zhuǎn)運(yùn)有直接相關(guān)的重要激酶。其中CK的同工酶CKMB在心肌損傷診斷中的特異性更高。當(dāng)心肌組織損傷嚴(yán)重時(shí)，CK-MB被釋放到血液中，血清中CK-MB的升高是診斷心肌損傷和急性心肌梗死的重要標(biāo)準(zhǔn)。如表2所示，模型大鼠CK-MB水平明顯升高，表明氣虛血瘀模型大鼠心肌出現(xiàn)損傷。YSZ、YSG、LXZ、LXG組均可以顯著降低CK-MB水平，表明不同生境人參莖葉總皂苷均具有良好的心肌保護(hù)作用。Na+-K+-ATP酶是實(shí)現(xiàn)Na+和K+的逆電化學(xué)梯度跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶，對(duì)于機(jī)體的能量代謝具有重要意義，可在一定程度上作為診療氣虛狀態(tài)的指標(biāo)[9-10]。本研究中模型組大鼠經(jīng)過(guò)游泳力竭聯(lián)合腎上腺素皮下注射造模后，血清中Na+-K+-ATP酶的活性較正常組顯著降低，經(jīng)不同劑量園參莖葉總皂苷和林下山參莖葉治療后，Na+-K+-ATP酶的活性均有不同程度的升高。

氣虛血瘀證與血管內(nèi)皮損傷也具有密切的聯(lián)系，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)釋放自分泌和旁分泌物質(zhì)，在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。張穎智等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀模型大鼠表現(xiàn)為NO的表達(dá)顯著降低，同時(shí)ET-1、TXB2的表達(dá)顯著升高，ET-1/NO比值升高。這種不平衡會(huì)導(dǎo)致血管張力增加、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致血栓的形成。NO是最重要的血管擴(kuò)張劑，維持基底血管平滑肌張力和抗動(dòng)脈粥樣硬化。另外，NO還能抑制內(nèi)皮衍生收縮因子，如ET-1、血管緊張素A和活性氧。TXB2和6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）分別是血栓素A2（TXA2）和前列環(huán)素I2（PGI2）的穩(wěn)定水解產(chǎn)物。TXA2是一種有效的血小板聚集和血管收縮的誘導(dǎo)劑，而PGI2是一種強(qiáng)大的血管擴(kuò)張劑，可抑制血小板聚集[11]?；ㄉ南┧崾荘GI2和TXA2的前體，其中環(huán)氧合酶（COX）在花生四烯酸代謝途徑中發(fā)揮重要作用，生成PGI2和TXA2[12]。以上研究結(jié)果提示氣虛血瘀證候可表現(xiàn)為血管收縮和舒張功能的異常，導(dǎo)致血小板聚集、血液黏度增加、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)一步引起血液流變學(xué)的改變。在此次研究中我們發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠NO（45.04±9.56μmol/L）的平均值顯著低于正常組，而ET-1（130.69±28.07 ng/L）、TXB2（144.38±34.88 ng/L）的平均值顯著高于正常組，該結(jié)果表明氣虛血瘀模型大鼠的成功建立；而園參莖葉總皂苷和林下山參莖葉總皂苷給藥組大鼠的三個(gè)指標(biāo)較模型組而言均存在不同程度的升高或降低，并且存在劑量依耐性。其中低劑量組（10 mg/kg）較模型組而言有升高或降低，但是沒(méi)有顯著性差異；而中劑量組（20 mg/kg）和高劑量組（40 mg/kg）較模型組有顯著性升高或降低，其中高劑量組的作用優(yōu)于中劑量組。然而園參莖葉總皂苷和林下山參莖葉總皂苷各等同劑量組比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上，就氣虛血瘀證候而言，同等劑量園參莖葉總皂苷的改善作用與林下山參莖葉總皂苷相當(dāng)。園參莖葉總皂苷和林下山參莖葉總皂苷均能改善氣虛血瘀模型大鼠的血液黏度，其作用機(jī)制與保護(hù)心肌細(xì)胞、保證能量代謝、改善內(nèi)皮功能等有關(guān)。后續(xù)我們將進(jìn)一步對(duì)兩種不同生境人參莖葉總皂苷進(jìn)行藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，發(fā)掘出針對(duì)氣虛血瘀證相關(guān)疾病的先導(dǎo)化合物，為不同生境人參莖葉資源的開(kāi)發(fā)與利用提供更充分的依據(jù)。