許 超，王法宇，趙天宇，李慶杰，黃曉巍*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.北京醫(yī)藥集團(tuán)職工大學(xué)，北京 100079；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021）

和解安神顆粒是由北柴胡、黃芩、龍骨、牡蠣等中藥經(jīng)提取制得的顆粒劑。本方劑是結(jié)合了歷代醫(yī)家大量臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和用藥標(biāo)準(zhǔn)而探索出的經(jīng)驗(yàn)方，針對(duì)肝郁化火型失眠等病癥有良好療效[1]。本研究擬采用顆粒劑代替臨床應(yīng)用時(shí)的湯劑，其顯著優(yōu)勢(shì)不僅在于湯劑吸收快，顯效迅速[2]，可以使本方中各類(lèi)藥物的提取效率提高，從而加強(qiáng)和解安神顆粒的產(chǎn)品質(zhì)量以及經(jīng)濟(jì)效益。還可以保證在藥材前處理和提取工藝不變的基礎(chǔ)上，對(duì)和解安神方中藥材的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的提取條件。

1 儀器和材料

1.1 儀器

島津高效液相色譜儀LC-20A，（杭州瑞析科技有限公司）；賽多利斯BSA224S-CW(220g)電子天平（廣州市深華生物技術(shù)有限公司）；KH-100B型超聲波清洗器（昆山和創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Dima C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。

1.2 材料

北柴胡、黃芩等9味藥材均購(gòu)于吉林省宏檢大藥房；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-201821）購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司；甲醇為色譜純（購(gòu)于美國(guó)菲世爾公司），其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 水煎煮工藝條件的考察

影響水煎煮法提取藥物的因素主要有3個(gè)，分別是：煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、加水量[3]。故使用正交表L9(34)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，每個(gè)因素3個(gè)水平,詳見(jiàn)表1。

表1 水煎煮的因素水平表

考察指標(biāo)：以醇溶性浸出物量黃芩苷加權(quán)后的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)方法

稱(chēng)取9份4倍于本方用量的原藥材飲片（每份256g）。照因素水平表的條件，對(duì)藥材按順序進(jìn)行以下試驗(yàn)步驟，包括：濾過(guò)、收集提取液、減壓濃縮及干燥，稱(chēng)重。計(jì)算干浸膏重量和出膏率。

2.3 醇溶性浸出物測(cè)定方法

按照2020版《中國(guó)藥典》四部通則下，醇溶性浸出物測(cè)定法的內(nèi)容進(jìn)行操作。

2.4 黃芩苷的含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

以Dima C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）為固定相；通過(guò)對(duì)乙腈-0.05%磷酸水溶液[4]乙腈-0.1%磷酸水溶液[5]，乙腈-0.2%磷酸水溶液[6]，乙腈-0.3%磷酸水溶液[7]，甲醇-0.4%磷酸水溶液[8]，乙腈-0.1%甲酸水溶液[9]，等不同的流動(dòng)相體系進(jìn)行考察，當(dāng)甲醇-4%磷酸水溶液(43：57)作為流動(dòng)相時(shí)，出峰的峰型及對(duì)稱(chēng)性好，故以此為流動(dòng)相；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量10μl；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫25℃。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備

在精密稱(chēng)量后的適量黃芩苷對(duì)照品中，加一定量甲醇制得黃芩苷對(duì)照品溶液，要求濃度為0.05mg/ml。

2.4.3 供試品溶液的制備

在50ml的容量瓶中放入0.5g研細(xì)的供試品，通過(guò)適量甲醇進(jìn)行稀釋并進(jìn)行30min超聲處理。然后自然冷卻，補(bǔ)加減失的甲醇至刻度。濾過(guò)后在10ml容量瓶中加入吸取的1ml續(xù)濾液，補(bǔ)加甲醇至刻度，在充分搖勻后濾過(guò)，取續(xù)濾液即可作為供試品溶液。

2.4.4 測(cè)定方法

分別在液相色譜儀中加入精密吸取的對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，得出結(jié)果后按下面公式計(jì)算黃芩苷的轉(zhuǎn)移率。

黃芩苷轉(zhuǎn)移率%=A2/A0×C0×D÷E×F÷W1÷Y÷1000×100

其中：A2為供試品峰面積；A0為對(duì)照品峰面積；C0為對(duì)照品溶液濃度（mg/ml)；D為供試品液總體積（ml）；E為供試品稱(chēng)樣量（g）；F為每組正交實(shí)驗(yàn)樣品得到的干浸膏重量（g）；W1為每組正交實(shí)驗(yàn)樣品中黃芩藥材投藥量（g）；Y為黃芩藥材中黃芩苷含量（%）。

2.4.5 線(xiàn)性關(guān)系的考察

分別吸取容量梯度為2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μl，濃度為0.05mg/ml的對(duì)照品溶液，通過(guò)高效液相色譜儀進(jìn)行含量分析。測(cè)定該容量下的峰面積，并將對(duì)應(yīng)容量下的色譜圖進(jìn)行記錄。以黃芩苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算回歸方程。得Y=4E+06X-15334，r=0.9998。結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣量在0.1～1.25μg之間時(shí)，黃芩苷進(jìn)樣量與對(duì)應(yīng)的峰面積之間，有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

以醇溶性浸出物占50%，黃芩苷轉(zhuǎn)移率占50%進(jìn)行加權(quán)，以醇溶性浸出物、黃芩苷轉(zhuǎn)移率和綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行分析，計(jì)算正交試驗(yàn)結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，詳見(jiàn)表2、3、4。

表2 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)及綜合評(píng)分

通過(guò)表4（方差分析）和表3（直觀(guān)分析）可知，以綜合評(píng)分為指標(biāo)，因素A（加水量）無(wú)顯著性、因素B（提取時(shí)間）無(wú)顯著性，因素C（煎煮次數(shù)）無(wú)顯著性。結(jié)合吸水率實(shí)驗(yàn)同時(shí)兼顧節(jié)能的原則，確定將A2B2C2作為最佳的提取條件組合，即加水煎煮2次，第一次加方中原藥材飲片8倍量的水，第二次加方中原藥材飲片6倍量的水，每次1.5h。

表3 正交試驗(yàn)L9(34)及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果表

綜合分析上述3個(gè)考察分析結(jié)果，以黃芩苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，提取次數(shù)具有顯著性（P＜0.05），說(shuō)明提取3次效果最佳。以醇提物量為指標(biāo)，加水量（P＜0.05）具有顯著性，煎煮次數(shù)具有極顯著性（P＜0.01），顯示提取2次的效果最好，且此時(shí)樣品中的黃芩苷轉(zhuǎn)移率仍然較高；以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，提取次數(shù)反而未見(jiàn)顯著性；本著兼顧各種有效成分的提取效率與節(jié)能原則，以分別加入8、6倍于方中原藥材飲片量的水，煎煮2次，1.5h/次為最優(yōu)提取工藝。

3.2 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

按照2.4項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果，分別考量3種不同的提取條件組合，以8、6倍于方中原藥材飲片的加水量煎煮2次，1.5h/次。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 水提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

由上述結(jié)果明顯可得，各工藝之間未見(jiàn)顯著性差異。確定最優(yōu)提取工藝為：加水煎煮2次，第一次加水量為方中原藥材飲片的8倍，第二次加水量為方中原藥材飲片的6倍，提取時(shí)間為1.5h/次。

4 結(jié)論與討論

4.1 結(jié)果

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)法充分考慮煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、加水量影響煎煮效果的三個(gè)因素之間的互相作用，進(jìn)行探究，以醇溶性浸出物、黃芩苷轉(zhuǎn)移率和綜合評(píng)分為指標(biāo)進(jìn)行分析，以充分尋求優(yōu)勢(shì)區(qū)間范圍。通過(guò)試驗(yàn)操作得出的數(shù)據(jù)分析，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)操作的便利性與節(jié)能性，最終確定最優(yōu)提取工藝為：分別加入8倍和6倍量水，煎煮2次，每次時(shí)間1.5h。

4.2 討論

中藥方劑的組成藥物種類(lèi)繁多，成分復(fù)雜，其療效大多是方中諸多中藥共同作用的結(jié)果。本文通過(guò)單因素考察，確定了影響和解安神方中各藥物提取效率的主要因素，采用正交試驗(yàn)探索出了最佳提取工藝條件。但在生產(chǎn)時(shí)對(duì)原料藥物采用的傳統(tǒng)水煎煮提取方式，普遍存在有效成分提取率低，雜質(zhì)含量高，水煎液久放易變質(zhì)等弊端。特別是柴胡作為本方中的君藥，柴胡總皂苷又作為一類(lèi)重要的活性成分，在本方中發(fā)揮了重要作用[10]。所以是否可用乙醇代替水作為提取溶劑對(duì)藥物進(jìn)行提取，不僅可以增加柴胡皂苷的提取效率，而且還可節(jié)約柴胡用量的同時(shí)保持藥效，達(dá)到節(jié)約藥材資源的目的。所以進(jìn)一步改進(jìn)的試驗(yàn)思路仍有待于研究。此外，本試驗(yàn)僅對(duì)水煎煮過(guò)程中的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，而在中藥顆粒劑后續(xù)加工過(guò)程中，水煎液提取物仍需涉及諸多工藝流程。包括提取液的純化，輔料的選擇，制軟材時(shí)軟材的軟硬程度，制粒方法的確定，以及最后干燥的溫度等相關(guān)顆粒劑后續(xù)加工流程并未涉及，所以仍需進(jìn)一步研究探討。

中藥產(chǎn)業(yè)作為國(guó)家大力支持發(fā)展的產(chǎn)業(yè)，其研究方法的水平和技術(shù)飛速提升，為中藥的發(fā)展提供新的發(fā)展機(jī)遇。中藥行業(yè)正在逐步汲取現(xiàn)代醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展成果，提升中藥行業(yè)理論水平、研究水準(zhǔn)，在研究傳統(tǒng)中藥組方的同時(shí)，關(guān)注中藥有效成分的分離和提取方法，改進(jìn)中藥的劑型和給藥途徑，為推進(jìn)中藥現(xiàn)代化奠定基礎(chǔ)。