李曉霞，劉忠英，孫嚴彤，劉 曉，汪戎錦

（吉林大學藥學院藥物分析教研室·吉林 長春·130021）

五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）屬木蘭科的一種藥用植物，多以其干燥成熟果實入藥[1]。大量研究發(fā)現，五味子果實、莖、根中含有包括木脂素類、多糖類、揮發(fā)油和有機酸等在內的大量活性成分[2-5]，從而發(fā)揮中樞神經系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等疾病的調節(jié)作用，具有較強的藥用價值[6,7]?，F代醫(yī)學研究表明，五味子具有神經保護、心血管保護、肝臟保護、血糖和血脂調節(jié)、抗癌等藥理作用，且常應用于神經系統(tǒng)和腎臟有關的疾病的臨床治療中[8-10]。

木脂素類化合物是五味子的主要活性成分[11]，約占五味子主要成分的8%[2]。其骨架結構是兩個C6-C3單元通過位置8和8’之間的鍵連接而成的聯苯環(huán)辛烯類化合物[4]。聯苯環(huán)辛烯型木脂素具有許多羥基和甲氧基，它們之間可能形成氫鍵并與蛋白質結合，使蛋白質的生物學活性發(fā)生改變，從而發(fā)揮藥理作用[12]。

目前，雖然對五味子木脂素的化學成分研究較多，卻依然未將多種木脂素成分和總木脂素含量的分析方法納入五味子質量標準的研究中。2020版《中國藥典》中僅以五味子醇甲作為含量測定指標。因此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）技術對五味子中8種木脂素成分進行測定，優(yōu)化液相方法，并進行方法學考察。結合20批不同產地五味子木脂素含量的定量分析結果，為后續(xù)五味子及其炮制品的質量評價、質量標準的建立奠定基礎。同時為其臨床應用的安全性和有效性提供科學依據。

1 實驗部分

1.1 藥材、試劑及儀器

五味子醇甲（中國食品藥品檢定研究院，批號：110857-201714）；五味子醇乙（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：180926）；當歸?；昝仔罤（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：180927）；五味子酯甲（中國食品藥品檢定研究院，批號：111529-201706）；五味子酯乙（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：181209）；五味子甲素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110764-201714）；五味子乙素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110765-201512）；五味子丙素（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：181020）；甲醇（天津新通精細化工有限公司）；變色酸（天津市光復精細化工研究所）；硫酸（沈陽市派爾精細化工制品）；乙腈（默克股份公司）；磷酸（賽默飛科技有限公司）；Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore Inc）；紫外-可見分光光度計（美國Thermo，型號：G10S UV-Vis）；高效液相色譜儀（德國1260 Agilent Technologies）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。20批五味子的產地、批號等信息，詳見表1。

表1 20批五味子信息表

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 供試品溶液制備

以序號為S1的吉林產五味子作為供試品進行條件優(yōu)化及方法學考察。取本品粉末（過三號篩）約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取甲醇20mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率20 kHz）20分鐘，取出，加甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得藥材的供試品溶液。

1.2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取取五味子醇甲、五味子醇乙、當歸酰基戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素對照品適量，加甲醇稀釋成每1 mL含五味子醇甲4.55 mg、五味子醇乙3.36 mg、當歸?；昝仔罤 1.78 mg、五味子酯甲1.60 mg、五味子酯乙1.76 mg、五味子甲素3.00 mg、五味子乙素1.65 mg、五味子丙素1.60 mg的對照品溶液。

1.2.2 HPLC檢測條件

選用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫條件見表2。流速1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長：220 nm；進樣量：10μL。

表2 梯度洗脫條件

1.2.3 方法學考察

通過專屬性實驗、線性考察、精密度考察、重復性考察、穩(wěn)定性考察以及加樣回收率考察對優(yōu)化出的HPLC檢測條件進行方法學考察，評價該方法的可行性。

1.2.4 不同產地五味子木脂素含量測定

精確稱量表1所示的20批不同產地的五味子藥材粉末，按照1.2.1進行樣品制備，并采用1.2.2的條件進行HPLC檢測，對20批不同產地五味子樣本的8種木脂素進行定量分析。

2 實驗結果

2.1 方法學考察結果

2.1.1 專屬性試驗

按1.2.1項下對照品溶液和供試品溶液的制備方法制備對照品溶液和供試品溶液。分別取甲醇為空白對照溶液、混合對照品為對照品溶液、供試品溶液，采用1.2.2中條件進行檢測。

從圖2中可以看出，五味子醇甲出峰時間在11.55 min附近；五味子醇乙出峰時間在15.36 min附近；當歸?；昝仔罤出峰時間在22.30 min附近；五味子酯甲出峰時間在31.86 min附近；五味子酯乙出峰時間在32.96 min附近；五味子甲素出峰時間在44.32 min附近；五味子乙素出峰時間在48.51 min附近；五味子丙素出峰時間在50.44 min附近?？瞻兹軇Ω鲗φ掌芳拔逦蹲訕悠烦煞址逦闯霈F干擾，表明該方法專屬性好，無雜峰干擾。

圖2 五味子專屬性考察

2.1.2 線性關系考察

精密吸取1.2.1項下各對照品儲備液一定體積配制成混合對照品溶液，稀釋得到系列濃度的混合對照品溶液。按1.2.2項下中的色譜條件進行測定，即得。以各對照品濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。對照品溶液在一定濃度下均具有線性關系，其回歸方程，詳見表3。

表3 8種五味子木脂素對照品標準曲線

2.1.3 精密度考察

用1.2.1項下方法制備對照品溶液，測定條件同1.2.2中的色譜條件，連續(xù)進樣6次，即得。結果表明，8種五味子木脂素的峰面積RSD值分別為0.52%、0.47%、0.49%、0.57%、0.52%、0.51%、0.47%、0.55%，均小于3.00%，表明該儀器精密度良好，符合定量分析要求。

2.1.4 重復性考察按1.2.1方法制備供試品溶液，測定條件同1.2.2中的色譜條件，連續(xù)進樣6次，即得。結果表明，8種五味子木脂素的峰面積RSD值分別為0.56%、0.46%、0.45%、0.42%、0.57%、0.32%、0.25%、2.87%，均小于3.00%，表明該方法重復性良好，符合定量分析要求。

2.1.5 穩(wěn)定性考察

按1.2.1方法制備供試品溶液，在制備后0、2、4、8、12、16、20、24 h時間點測定，測定條件同1.2.2中的色譜條件。

結果表明，8種五味子木脂素的峰面積RSD值分別為0.21%、0.30%、0.46%、0.83%、0.33%、0.84%、0.73%、2.73%，均小于3.00%，表明供五味子試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好，符合定量分析要求。

2.1.6 重現性考察

按1.2.1方法制備同一批五味子供試品溶液6份，測定條件同1.2.2中的色譜條件，連續(xù)進樣6次，即得。結果表明，8種五味子木脂素的含量的RSD值分別為0.53%、0.73%、2.09%、1.26%、0.28%、0.32%、0.27%、2.31%，均小于3.00%，表明該方法重現性良好，符合定量分析要求。

2.1.7 加樣回收率考察

按1.2.1方法制備同一批五味子供試品溶液6份，測定條件同1.2.2中的色譜條件，連續(xù)進樣6次，即得。

由表4可得，8種五味子木脂素的加樣回收率在90～110%之間；RSD值均小于3.00%，表明該方法回收率良好，符合定量分析要求。

表4 加樣回收率考察

2.2 20批不同產地五味子木脂素成分含量測定

將20批不同產地的五味子中8種木脂素的含量進行定量分析，結果見表5。

表5 20批五味子木脂素成分含量測定結果

3 討論

通過測定波長、色譜柱、流動相種類、流速及柱溫條件的優(yōu)化從而篩選出五味子木脂素定量的最佳HPLC檢測條件。

3.1 測定波長的選擇

在DAD檢測器掃描下，得到五味子3D譜圖，由樣品和混合對照品溶液的全掃圖可得出五味子木脂素類化合物在220、250、280 nm處有最大吸收。五味子木脂素在220 nm下均具有很強的吸收，木脂素類成分出峰數目多，響應值高，故選擇測定波長為220nm。

3.2 色譜柱的選擇

分別選用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱和Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，比較采用不同色譜柱時五味子木脂素的分離效果。通過分析樣品峰利用不同色譜柱進行檢測時的分離度、峰形等指標，得出Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱分離度低、峰形差、且基線不穩(wěn)。采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱檢測時，五味子酯甲、五味子酯乙的分離度低。Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱檢測時，樣品峰的分離度及峰形較好，色譜峰分布均勻。最終選用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱進行基于高效液相色譜法的木脂素定量研究。

3.3 流動相種類的選擇

改變流動相種類，比較選擇不同流動相時，五味子木脂素的分離效果，從而選擇最佳的流動相種類。通過分析樣品峰在不同條件下的分離度、峰形等指標，得出乙腈（A）-0.5%磷酸水（B）、乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）為流動相時，基線不平穩(wěn)。乙腈（A）-水（B）為流動相時，五味子醇甲等待測成分具有較高分離度、峰形較好且基線平穩(wěn)。最終選用乙腈（A）-水（B）作為流動相。

3.4 流速的選擇

改變流動相流速，比較不同流速時，色譜圖中五味子木脂素的分離效果，從而選擇最優(yōu)流速。結果表明，當流速為0.8 mL/min時，4號峰分離度較低。流速為1.2 mL/min時，6號峰和7號峰的峰形不好，而流速為1.0 mL/min時各峰分離度高、峰形好，綜合分析樣品峰在不同條件的分離度、峰形，最終選擇流速為1.0 mL/min。

3.5 柱溫的選擇

改變色譜柱溫度，比較不同柱溫時，色譜圖中五味子木脂素的分離效果，從而選擇最優(yōu)檢測柱溫。結果表明，當柱溫為35℃時，指標峰分離度較差；柱溫為25℃時，1號峰分離度較低；柱溫為30℃時，各指標峰的分離度及理論塔板數達到標準，綜合分析樣品峰在不同條件的分離度及峰形，最終選擇在柱溫為30℃條件下進行檢測。

4 結論

本研究建立了一種基于HPLC技術同時測定五味子中8種木脂素成分含量的檢測方法。通過實驗條件優(yōu)化，最終確定選用Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以乙腈和水為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為220nm的含量測定方法。按2020年版《中國藥典》的有關規(guī)定，進行一系列方法學考察，包括專屬性、線性范圍、精密度、準確度、穩(wěn)定性和加樣回收率考察。并采用此方法對20批不同產地的五味子中8種木脂素進行定量分析。結果表明，本文所建立的五味子木脂素成分含量測定方法靈敏、專屬性強、精密度高、重復性好，加樣回收率在93.38%～103.87%（n=6）范圍，且RSD值均小于3.00%。本方法能夠同時檢測8種木脂素含量，色譜峰的分離度較高，具有較好的峰形，且操作簡便易行。因此，可將此方法作為該藥材的指標評價方法，并可為今后五味子藥材的質量評價提供參考標準及科學依據。

綜上，本研究建立的五味子指紋圖譜結合木脂素定量分析方法，能夠客觀地反映五味子內在質量的一致性與真實性，為制定五味子這一傳統(tǒng)中藥的質量標準與品質評價模式提供重要的理論依據。