楊海涵，胥世洪，李 軍，房春林

(1.成都乾坤動(dòng)物藥業(yè)股份有限公司，四川 成都 610000；2.四川省獸藥監(jiān)察所，四川 成都 610000；3.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 610000)

0 引言

VA、VD3、VE常作為添加劑用于畜禽飼料中，特別是預(yù)混合維生素飼料中，三者同時(shí)添加的概率比較大[1-3]。在現(xiàn)行的預(yù)混合維生素飼料檢測(cè)方法中，3種維生素分別進(jìn)行直接提取后檢測(cè)，三者流動(dòng)相均為甲醇:水(98:2)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為326 nm、264 nm、285 nm，流速等其他條件差異不大[4-6]。在檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，VA、VD3、VE均能出現(xiàn)分離度合格的色譜峰，因此，試驗(yàn)對(duì)VA、VD3、VE同時(shí)測(cè)定展開(kāi)研究[7]。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent-1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；島津SPD-M20A、LC-15C、LC-20A高效液相色譜儀，島津(中國(guó))有限公司；BP211D型分析天平，中國(guó)(北京)賽多利斯有限公司；UV-1800PC紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海美諾達(dá)儀器有限公司。

VA醋酸酯對(duì)照品，中國(guó)藥品食品檢定研究院，含量98%，批號(hào)100368-201502；VD3對(duì)照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量98%，批號(hào)F1813051；D-α-生育酚對(duì)照品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量97%，批號(hào)H1815030。

維生素預(yù)混合飼料“多維營(yíng)養(yǎng)素”，VA、VD3、VE均為水溶性包合物，成都欣牧生物科技有限公司，批號(hào)為20200408。

1.2 方法

1.2.1 波長(zhǎng)選擇

分別精密稱(chēng)取VA、VD3、VE對(duì)照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，使分別含VA、VD3、VE約1 mg/mL，于200～400 nm掃描，確定3種維生素均有吸收的波長(zhǎng)范圍。根據(jù)紫外掃描結(jié)果，分別對(duì)VA、VD3、VE混合液進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為甲醇:水(98:2)，柱溫30℃，流速1 mL/min。記錄色譜圖，分析主峰的峰面積大小、分離度、理論板塔數(shù)及對(duì)稱(chēng)性，從而選擇最優(yōu)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密配置含VA 0.173 0 mg/mL、VD30.161 7 mg/mL、VE 2.111 6 mg/mL的混合溶液，倍比稀釋6次。將以上7種溶液分別注入液相色譜儀檢測(cè)，記錄峰面積，并以峰面積對(duì)濃度作圖，分別得到3個(gè)維生素的線型回歸方程，r2應(yīng)不小于0.999 9。

1.2.3 條件穩(wěn)定性評(píng)估

按照獸藥典的規(guī)定，對(duì)建立方法的精密度、重復(fù)性、回收率進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)符合規(guī)定。

1.2.4 樣品檢測(cè)及實(shí)用性試驗(yàn)

取預(yù)混合維生素添加劑樣品，分別用Agilent-1260高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器，SB-C18色譜柱)、島津SPD-M20A高效液相色譜儀(光電二極管陣列紫外檢測(cè)器，島津OSD-2色譜柱)、島津LC-15C高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器，依利特OSD-2色譜柱)、島津LC-2010-AHT高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器，島津OSD-2色譜柱)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算樣品含量并進(jìn)行分析，各種設(shè)備檢測(cè)結(jié)果差異應(yīng)不顯著。

1.2.5 與原方法比較

取預(yù)混合維生素添加劑樣品，分別用VA、VD3、VE單獨(dú)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，差異應(yīng)不顯著。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件選擇

將VA、VD3、VE的混合溶液置于紫外-可見(jiàn)風(fēng)光光度計(jì)掃描，發(fā)現(xiàn)279～290 nm VA、VD3、VE的吸收值相對(duì)平衡。通過(guò)高效液相色譜間隔3 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)波長(zhǎng)為288 nm時(shí)，VA、VD3、VE 3個(gè)主峰的峰面積、分離度、理論板塔數(shù)及峰的對(duì)稱(chēng)性等均優(yōu)于其他波長(zhǎng)。調(diào)整流動(dòng)相中甲醇濃度，并檢測(cè)3種維生素在30 min內(nèi)的圖譜，當(dāng)甲醇濃度為98%、100%時(shí)，3種維生素均在30 min內(nèi)出峰，但峰的分離度98%優(yōu)于100%，因此，以甲醇:水(98:2)作為流動(dòng)相。

2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

將含有VA、VD3、VE的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，倍比稀釋后。分別注入液相色譜儀測(cè)定峰面積并記錄，并用測(cè)得峰面積對(duì)濃度作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

VA:y=14 113x+22.271，R2=0.999 9，線性范圍:0.002 7～0.173 0 mg/mL。

VD3:y=0 056x+7.535 6，R2=0.999 9，線性范圍:0.002 5～0.161 7 mg/mL。

VE:y=10 217x+132.78，R2=0.999 9，線性范圍:0.033 0～2.111 6 mg/mL。

2.3 精密試驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品混合液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并分析，得出3種維生素的變異系數(shù)均(R)小于2.0%，分別為1.30%、0.52%、0.47%，說(shuō)明本系統(tǒng)精密度良好，具體如表1所示。

表1 精密度試驗(yàn)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取預(yù)混合維生素飼料樣品6份，加甲醇稀釋后，將6種溶液分別精密量取10 μL濾過(guò)后注入液相色譜儀檢測(cè)，記錄峰面積并分析，發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)(R)均<2.0%，分別為0.46%、1.30%、0.28%(見(jiàn)表2)。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)

2.5 回收率試驗(yàn)

按照重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下處理樣品溶液，分別加入對(duì)照品使溶解。搖勻后稀釋至刻度，濾過(guò)后注入液相色譜儀檢測(cè)，記錄峰面積計(jì)算溶液濃度，并計(jì)算對(duì)照品的平均回收率分別為100.10%、99.20%、97.92%(均>95%)[7]，變異系數(shù)(R)均<2.0%，分別為0.96%、0.86%、1.23%，說(shuō)明該方法回收率良好，重復(fù)性高，如表3所示。

表3 3種維生素回收率試驗(yàn)

2.6 適用性試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下稀釋樣品(5 g→100 mL)，分別用4種不同液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算含量并進(jìn)行分析，結(jié)果得出各組數(shù)據(jù)差異不顯著(p<0.05)，說(shuō)明該方法可以同時(shí)測(cè)定預(yù)混合飼料添加中VA、VD3、VE的含量，且適用性較好，如表4所示。

表4 適用性試驗(yàn) 單位：mg/mL

2.7 與原方法比較

取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下稀釋樣品(5 g→100 mL)，分別用VA、VD3、VE單獨(dú)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，與該實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，差異不顯著(t<0.05)，具體如表5所示。

表5 與原方法比較 單位：mg/mL

3 結(jié)論

綜上所述，該方法可用于預(yù)混合維生素飼料中VA、VD3、VE的含量測(cè)定。線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性及回收率均比較良好，因此，此法可以用于實(shí)際生產(chǎn)中，其具體參數(shù)為流動(dòng)相甲醇:水(98:2)，波長(zhǎng)288 nm、柱溫30℃，流速1.0 mL/min。另外，該次試驗(yàn)用甲醇:水(98:2)為流動(dòng)相，檢測(cè)范圍分別為2.7～173.0 μg/mL，2.5～161.7 μg/mL，33.0～2 111.6 μg/mL，與文獻(xiàn)比較，VA和VE的檢測(cè)限度較低，流動(dòng)相相對(duì)簡(jiǎn)單[8-9]。

該次試驗(yàn)中，對(duì)樣品的處理仍然采用原標(biāo)準(zhǔn)中的處理方法，即精密稱(chēng)定樣品，加入適量甲醇，60℃超聲處理1 h，冷卻后加甲醇至刻度。原標(biāo)準(zhǔn)中需要調(diào)整3次波長(zhǎng)，按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣方法需要進(jìn)樣9次，甲醇的消耗量比較大，且所需時(shí)間較長(zhǎng)，該次試驗(yàn)將甲醇的消耗和所需時(shí)間均降低至原來(lái)的1/3，因此，優(yōu)于3種維生素的單獨(dú)測(cè)定。但是，該次試驗(yàn)只針對(duì)能直接提取VA、VD3、VE的預(yù)混合維生素飼料樣品檢測(cè)，對(duì)于動(dòng)物或植物體內(nèi)需要進(jìn)行轉(zhuǎn)化后或者成分復(fù)雜樣本的VA、VD3、VE的檢測(cè)，需要進(jìn)一步研究。