張 宇，陳伶知，胡 譽(yù)，胡雨靜，任嘉敏，唐建洲，彭 亮

(長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 長沙 410022)

0 引言

隨著我國飼料工業(yè)的快速發(fā)展，常規(guī)蛋白原料如豆粕、魚粉的價(jià)格不斷上漲，飼料成本急劇增加，采用植物源蛋白替代魚粉以降低飼料成本成為市場關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。但植物源蛋白相比于魚粉缺少?；撬?。牛磺酸是畜禽必需的一種氨基酸，具有提高畜禽生長、繁殖性能、改善免疫力，促進(jìn)采食等生物學(xué)功能[2]。

芝麻粕為芝麻榨油后的產(chǎn)物，粗蛋白含量高達(dá)38%～50%，蛋氨酸含量非常高，而蛋氨酸正是牛磺酸合成途徑的前體物質(zhì)之一[3]。有研究表明，植物粕類可通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生牛磺酸，有效降低粕類中的抗?fàn)I養(yǎng)因子[4]，發(fā)酵產(chǎn)生的活性肽等容易被腸道黏膜直接吸收，并且采用多菌種固態(tài)發(fā)酵方法比單菌種發(fā)酵營養(yǎng)成分更為豐富[5]，可以補(bǔ)充大量活性益生菌，抑制有害菌的生長，改善腸道的微生態(tài)平衡，減少病害的發(fā)生[6]。另外，如果在飼料中直接添加?；撬嵋部梢赃_(dá)到效果，但是其成本高，飼喂效果不明顯[7-8]。因此本研究采用枯草芽孢桿菌YS-45、酵母S-78、黑曲霉PL-39共同發(fā)酵芝麻粕生產(chǎn)富含牛磺酸的菌氨肽飼料，以期代替或部分代替魚粉，為飼料原料替代提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)實(shí)驗(yàn)菌株：枯草芽孢桿菌YS-45、酵母S-78、黑曲霉PL-39，長沙學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。

2)主要試劑及發(fā)酵原料：?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；大米、芝麻粕、麩皮、豆粕均購買于長沙青草生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、超純水系統(tǒng)、LGJ-10冷凍干燥機(jī)、高效液相色譜儀(島津LC-6AD)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)菌種活化及種子擴(kuò)大培養(yǎng)。酵母菌、枯草芽孢桿菌活化條件為30℃，培養(yǎng)72 h；黑曲霉活化條件為37℃，培養(yǎng)120 h。將活化后的菌種制成菌懸液，按5%的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min，培養(yǎng)14～16 h，即制成種子菌懸液。

2)固體發(fā)酵。稱取發(fā)酵基質(zhì)20 g，混合均勻，121℃滅菌25 min。將制備的枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉種子菌懸液，接種到基質(zhì)中，在固態(tài)發(fā)酵罐中，30℃條件下發(fā)酵、烘干，即得富含牛磺酸的活性菌氨肽飼料。

3)設(shè)置7個(gè)處理組，每組3個(gè)平行，每瓶總量為20 g。原料基質(zhì)打粉過60目篩，分裝至250 mL錐形瓶中，121℃滅菌25 min。分別將3種種子菌懸液接種到發(fā)酵基質(zhì)中，于30℃下發(fā)酵72h，烘干樣本備用?；|(zhì)配比如下：處理1，大米10 g、麩皮5 g、豆粕5 g、芝麻粕0 g；處理2，大米10 g、麩皮0 g、豆粕5 g、芝麻粕5 g；處理3，大米10 g、麩皮5 g、豆粕0 g、芝麻粕5 g；處理4，大米20 g、麩皮0 g、豆粕0 g、芝麻粕0 g；處理5，大米0 g、麩皮20 g、豆粕0 g、芝麻粕0 g；處理6，大米0 g、麩皮0 g、豆粕20 g、芝麻粕0 g；處理7，大米0 g、麩皮0 g、豆粕0 g、芝麻粕20 g。

4)不同菌種比例對(duì)活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯俊Ｈ“l(fā)酵基質(zhì)20 g分裝滅菌，冷卻接種，枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉為1:1:1、1:1:2、1:2:1、2:1:1，4個(gè)不同處理，每個(gè)處理3個(gè)平行，按體積比5%接種，于30℃下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為72 h，烘干樣本備用。

5)不同含水量對(duì)活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯?。按30%、35%、40%的含水量配制發(fā)酵基質(zhì)，各取發(fā)酵基質(zhì)20 g，每組設(shè)置3個(gè)平行樣，滅菌，冷卻接種，按體積比5%接種，于30℃下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為72 h，烘干樣本備用。

6)不同接種量對(duì)活性菌氨肽飼料中牛磺酸含量的影響研究。取發(fā)酵基質(zhì)20 g，按接種量為2%、4%、6%，每組設(shè)置3個(gè)平行樣，于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h，烘干樣本備用。

7)不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯俊Ｈ“l(fā)酵基質(zhì)20 g分裝滅菌，冷卻接種，于30℃下發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間分別為48 h、72 h、96 h，烘干樣本備用。

8)?；撬針悠窓z測預(yù)處理。采用35 mL雙蒸水溶解5 g樣品，混勻后離心取上清，備用。上清液中加入等量三氯乙酸(10%)溶液混勻，靜置10 min后再加等量乙醚脫脂，離心取上清，蒸至5 mL，取樣100 μL加入300 μL衍生劑混勻衍生30 min，凍干，溶于1 mL雙蒸水，離心取上清，用高效液相色譜儀分析。

9)高效液相色譜法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中牛磺酸的含量。配制流動(dòng)相A、B液，將樣品和?；撬針?biāo)準(zhǔn)品上機(jī)檢測，通過計(jì)算牛磺酸含量。流動(dòng)相配如下:A液:11.45 g無水醋酸鈉，溶于800 mL雙蒸水，加入100 μL三乙胺，定容至1 000 mL，冰醋酸調(diào)pH 5.8，取該溶液940 mL加入60 mL乙腈，0.45 μm膜過濾，超聲波除氣。B液:取600 mL乙腈，雙蒸水稀釋至1 000 mL，超聲波除氣。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵基質(zhì)對(duì)菌氨肽飼料中牛磺酸含量的影響

7個(gè)組合都能產(chǎn)生?；撬?，但是以純麩皮為發(fā)酵底物，?；撬岷孔钌?，這是由于麩皮中，合成?；撬岬那绑w物質(zhì)蛋氨酸含量較低，只有0.18%左右。而發(fā)酵底物含豆粕或芝麻粕時(shí)，牛磺酸含量有所提升，這是因?yàn)槎蛊珊椭ヂ槠芍械鞍彼岷勘容^高。當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純豆粕時(shí)，?；撬岷棵黠@高于部分添加豆粕的兩組，這是因?yàn)橥荣|(zhì)量的豆粕中蛋氨酸含量要明顯高于大米和麩皮；當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純大米時(shí)，牛磺酸含量也比較高，這可能是由于大米中營養(yǎng)成分相對(duì)比較全面，適合菌體生長和?；撬徂D(zhuǎn)化的原因。而當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純芝麻粕時(shí)，牛磺酸含量最高，這是因?yàn)橹ヂ槠芍懈缓铣膳；撬岬那绑w物質(zhì)蛋氨酸，其含量高達(dá)0.82%。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行以芝麻粕為底物的發(fā)酵工藝探索。多菌種發(fā)酵不同底物?；撬岷繖z測結(jié)果如圖1所示。

圖1 多菌種發(fā)酵不同底物牛磺酸含量檢測結(jié)果

2.2 不同菌種比例發(fā)酵后?；撬岷繖z測結(jié)果

不同菌種比例處理組?；撬岷慷荚?.9%以上，菌種比例枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉=1:2:1時(shí)發(fā)酵效果最好?？赡芙湍钢饕玫鞍彼徇M(jìn)行菌體生長，是促進(jìn)?；撬岷铣傻年P(guān)鍵菌種，或者在這個(gè)比例下，3種菌協(xié)同生長狀態(tài)最好。

2.3 不同含水量發(fā)酵后?；撬岷繖z測結(jié)果

由圖2可知，不同含水量處理組中，含水量為35%處理組牛磺酸含量最高?？赡艿脑蚴?0%含水量不足夠3種菌種同時(shí)生長；而40%含水量過多，導(dǎo)致黑曲霉生長過慢，影響整體發(fā)酵效果。

圖2 不同含水量檢測結(jié)果

2.4 不同接種量發(fā)酵后?；撬岷繖z測結(jié)果

由圖3可知，不同接種量處理組中，4%的接種量發(fā)酵效果好?？赡艿脑蚴?%的接種量下，菌體前期生長迅速，但由于中期菌體數(shù)量過多，產(chǎn)酸較多不利于3種菌綜合生長。

圖3 不同接種量檢測結(jié)果

2.5 不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵后?；撬釞z測結(jié)果

由圖4可知，不同發(fā)酵時(shí)間組中，發(fā)酵時(shí)間為72 h最好。48 h可能由于發(fā)酵時(shí)間較短，菌種數(shù)量不夠?qū)е掳l(fā)酵效果較差；96 h可能有菌體已經(jīng)發(fā)生自溶，不再利于?；撬岬姆e累。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間檢測結(jié)果

2.6 最佳單因素條件下發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繖z測結(jié)果

通過單因素實(shí)驗(yàn)法探索出最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:發(fā)酵時(shí)間為72 h，菌種接種比例為枯草:酵母:黑曲霉=1:2:1，含水量為35%，接種量為4%。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繛?.5%。通過查閱文獻(xiàn)可知，進(jìn)口魚粉牛磺酸含量為0.514%～1.06%，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多菌種發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)物中牛磺酸含量是優(yōu)質(zhì)魚粉的1.4倍。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用單因素方法，確定了芝麻粕活性菌氨肽飼料中牛磺酸的最佳發(fā)酵工藝為:含水量35%，菌種比例為枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉=1:2:1，接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間為72 h，綜合條件下發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繛?.5%。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用微生物發(fā)酵的方法，解決了植物源蛋白抗?fàn)I養(yǎng)因子的問題，可以通過加入芝麻粕，代替或部分代替魚粉，解決了植物源蛋白制備小肽飼料缺乏?；撬岬膯栴}，具有創(chuàng)新意義，為新型蛋白飼料的研發(fā)提供了理論依據(jù)。