王靜 胡艷 朱曼 胡芮維 張洪為 黃遠(yuǎn)帥

血小板是一種極為重要的血液成分。目前，常用的血小板制品有富血小板血漿、濃縮血小板和單采血小板等，其中單采血小板可以減少同種免疫反應(yīng)的發(fā)生和血液傳播性疾病的感染風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前由于臨床對于血小板的需求日漸增大，血小板制劑供不應(yīng)求，并且血小板存在儲存過程的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和代謝等不良變化，導(dǎo)致其體外的活化和血小板功能損傷，儲存時(shí)間短，儲存期質(zhì)量下降影響輸注效果，所以我們需要探索延長血小板儲存期限以及增進(jìn)血小板儲存期質(zhì)量的方法，以緩解臨床用血小板緊張的問題。

血小板在體外采集和制備過程中，由于暴露于異物表面和高離心力等一系列機(jī)械因素引起血小板活化、碎裂；在儲存過程中，血小板自身凋亡，血小板糖酵解增強(qiáng)和線粒體功能的降低導(dǎo)致血小板內(nèi)乳酸堆積，血小板表面蛋白表達(dá)改變，血小板內(nèi)免疫活性蛋白積累，這一系列的變化稱為血小板儲存損傷（platelet storage lesion，PSL）[2]。在低溫條件下血小板可以產(chǎn)生可逆性的代謝減慢以減緩血小板保存期間的活化，并且降低了常溫保存下易滋生細(xì)菌的風(fēng)險(xiǎn)[3]。但是低溫會導(dǎo)致血小板發(fā)生低溫?fù)p傷，輸入人體后肝臟部位的巨噬細(xì)胞在2～3天內(nèi)就會將血小板吞噬清除，血小板輸注回收率降低，從而導(dǎo)致血小板輸注無效（platelet transfusion refractoriness，PTR）[4-5]。

近年來許多研究人員從血小板保存添加劑中探索延長血小板保存期限和改善血小板質(zhì)量的方法。其中有研究表明一氧化氮（nitric oxide，NO）能夠抑制血小板活化從而增進(jìn)血小板保存質(zhì)量[6-8]。RADOMSKI MD等[9]研究發(fā)現(xiàn)NO能在一定程度上抑制血小板的活化聚集。目前已有NO水溶液和多種類型NO供體運(yùn)用于NO對血小板作用機(jī)制的研究中，但是不同類型的NO供體的作用強(qiáng)度和具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究通過使用文獻(xiàn)中尚無研究的多胺類NO供體四鹽酸精胺來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用不同濃度的四鹽酸精胺處理不同儲存時(shí)間節(jié)點(diǎn)的單采血小板，檢測其作用產(chǎn)生的NO含量、血小板活化標(biāo)志物CD62p的表達(dá)以及兩者的關(guān)系，初步探討NO供體在血小板保存中的作用，報(bào)告如下。

材料與方法

1 血小板樣本來源 由瀘州市中心血站提供，采自三位健康獻(xiàn)血者的保存1 d、3 d、5 d的單采血小板。

2 儀器與試劑 熒光/發(fā)光酶標(biāo)儀（FLx800，Biotek 公司，美國）；流式細(xì)胞分析儀（FACS Salibur，BD公司，美國）；電子分析天平（AUW320，島津公司，日本）；四鹽酸精胺Spermine（批號：C11608259，畢得醫(yī)藥科技有限公司，上海）；PE Anti-human CD62p（貨號：304906，蘭博利德商貿(mào)有限公司，北京）；NO含量測定試劑盒（批號：20201216，齊一生物科技有限公司，上海）；PBS溶液（pH 7.35～7.45）。

3 實(shí)驗(yàn)樣本處理 將儲存1 d、3 d、5 d的血小板各自隨機(jī)分裝為A、B、C、D、E、F六個組，每組400 μL，設(shè)三組平行實(shí)驗(yàn)。用PBS溶液配制10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L、50 mmol/L五種不同濃度的四鹽酸精胺溶液，向?qū)嶒?yàn)組A、B、C、D、E注射四鹽酸精胺溶液各40 μL，其濃度依次為A組10 mmol/L、B組20 mmol/L、C組30 mmol/L、D組40 mmol/L、E組50 mmol/L，F(xiàn)組為對照組注入等量PBS溶液，設(shè)三組平行實(shí)驗(yàn)。所有操作均在生物安全柜內(nèi)完成。

4 血小板NO濃度 采用一步法NO測定試劑盒測量血小板NO濃度。具體操作流程參照試劑盒說明書。

5 血小板活化標(biāo)志物檢測 PBS對照組和用不同濃度四鹽酸精胺處理后的各實(shí)驗(yàn)組，在處理后的60 min時(shí)嚴(yán)格按照PE Anti-human CD62p試劑盒說明書采用流式細(xì)胞儀分別測定PBS對照組和各實(shí)驗(yàn)組血小板膜表面CD62p的表達(dá)率。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用Stata15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism8.0.1繪圖。符合正態(tài)性的數(shù)值型變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述。采用Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)考察數(shù)值型變量的正態(tài)性，Levene方差齊性檢驗(yàn)考察數(shù)值型變量組間方差齊性。源自同一樣本的血小板經(jīng)多種濃度處理后，采用配伍組設(shè)計(jì)方差分析比較熒光強(qiáng)度和濃度，若多種處理間差異顯著，則采用SNK法進(jìn)行預(yù)先設(shè)定的組間兩兩比較。正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.1（雙尾），余檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為α=0.05（雙尾）。

結(jié) 果

1 血小板NO含量 同一樣本的血小板經(jīng)6種不同處理措施及不同存儲時(shí)間（1 d、3 d和5 d）的NO含量變化趨勢如圖1所示。對于同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)而言，采用配伍組設(shè)計(jì)方差分析對6種不同處理措施血小板的NO含量進(jìn)行比較，表明6種處理措施間具有顯著差異（F=489.88，P＜0.001），經(jīng)SNK法進(jìn)一步兩兩比較，見表1。相較于PBS對照組，四鹽酸精胺處理后的血小板NO濃度均一定程度升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。四鹽酸精胺濃度的變化對儲存1 d、3 d和5 d的血小板NO濃度的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖1）。血小板NO濃度隨著四鹽酸精胺濃度的增加而增加，對儲存3 d的血小板作用最為顯著。各四鹽酸精胺濃度的實(shí)驗(yàn)組間在同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)的NO濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 不同濃度四鹽酸精胺處理血小板NO濃度的SNK法兩兩比較

圖1 不同濃度（mmol/L）四鹽酸精胺處理血小板的NO濃度變化

3 血小板活化標(biāo)志物（CD62p）的表達(dá) 不同濃度四鹽酸處理不同儲存時(shí)間（1 d、3 d和5 d）的血小板和對照組血小板CD62p表達(dá)的熒光強(qiáng)度變化趨勢如圖2所示：隨著儲存時(shí)間的增加而增多，儲存5 d的血小板表達(dá)最多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對于同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)而言，采用配伍組設(shè)計(jì)方差分析對6種不同處理措施血小板的CD62p表達(dá)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，表明6種處理措施間具有顯著差異（F=924.64，P＜0.001），經(jīng)SNK法進(jìn)一步兩兩比較，見表2。在加入四鹽酸精胺處理后，血小板CD62p表達(dá)均一定程度下降，與PBS對照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖2）。隨著四鹽酸精胺濃度的增加，CD62p表達(dá)的抑制程度越強(qiáng)，到約40 mmol/L抑制程度趨于穩(wěn)定，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。用SNK比較法分析得到，40 mmol/L和50 mmol/L的四鹽酸精胺對儲存3 d、5 d的血小板CD62p表達(dá)的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.085；P=0.078，P＞0.05）（表2）。

表2 不同濃度四鹽酸精胺處理血小板CD62p的SNK法兩兩比較

圖2 不同濃度四鹽酸精胺處理血小板的CD62P熒光強(qiáng)度變化趨勢分析

討 論

國內(nèi)外由于臨床對于血小板的需求量持續(xù)增加，供不應(yīng)求，并且由于血小板質(zhì)量受各種保存因素影響大，輸血風(fēng)險(xiǎn)隨著儲存時(shí)間的增加而增大等情況，嚴(yán)重的血小板短缺正在持續(xù)增加[10-11]。

有研究發(fā)現(xiàn)NO在體內(nèi)能激活血小板中的鳥苷酸環(huán)化酶（soluble guanylate cyclase，sGC），sGC能夠催化三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）生成環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP），從而參與一系列蛋白質(zhì)的磷酸化反應(yīng)的調(diào)節(jié)，抑制血小板活化和聚集[12]。我們的研究通過添加NO供體四鹽酸精胺來探討血小板NO與血小板活化標(biāo)志物CD62p之間的關(guān)系，四鹽酸精胺對血小板的作用及其可能的機(jī)制。

從本實(shí)驗(yàn)的PBS對照組血小板NO濃度檢測結(jié)果可知，血小板NO濃度隨著儲存時(shí)間的增加而減少，這提示血小板離體后在儲存期間NO逐漸被消耗。在不加入任何干擾劑的情況下，離開循環(huán)系統(tǒng)的血小板自身能夠通過內(nèi)源性途徑生成NO，但NO的生成量是有限的。離開機(jī)體后，血小板不能從血管內(nèi)皮細(xì)胞獲取NO，隨著儲存時(shí)間的增加，NO逐漸被血小板消耗，所以血小板NO濃度逐漸降低。

CD62p又稱為P-選擇素，它在血小板活化期間轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜[13]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著儲存時(shí)間的增加，血小板膜表面的活化標(biāo)志物CD62p表達(dá)逐漸增加，說明在存儲期間血小板活化增強(qiáng)。通過我們的實(shí)驗(yàn)可知，隨著儲存時(shí)間增加，血小板NO濃度降低，CD62p表達(dá)增加，所以NO與CD62p表達(dá)之間可能存在對應(yīng)的關(guān)系。因此，可以通過體外添加NO氣體水溶液和NO供體等方式直接在體外向離體的血小板持續(xù)穩(wěn)定地供給外源性的NO，以維持血小板儲存期的生理調(diào)節(jié)，抑制儲存期間血小板的活化。目前相關(guān)研究主要是用NO氣體作為血小板外源性NO，而NO供體在一定條件下釋放的NO也可作為血小板外源性NO。NO供體主要包括硝普納、有機(jī)硝酸酯類及亞硝酸酯類等。在常溫儲存血小板期間加入NO供體S-亞硝基乙酰青霉胺能夠在血小板代謝、乳酸生成和血小板活化率方面一定程度上減少PSL[14]。S-亞硝基谷胱甘肽作為另一種NO供體，同樣能夠在儲存期間改善血小板代謝，減緩乳酸生成[15]。亞硝酸鹽通過直接激活鳥苷酸環(huán)化酶和磷酸化磷酸蛋白Ser299獨(dú)立于NO以及其他的血液成分如線粒體（白細(xì)胞）或血紅蛋白（紅細(xì)胞）等來抑制血小板聚集[16]。我們的研究通過添加NO供體四鹽酸精胺來探討血小板NO與血小板活化標(biāo)志物CD62P之間的關(guān)系，四鹽酸精胺通過鳥苷酸環(huán)化酶和磷酸化磷酸蛋白對血小板的作用及其可能的機(jī)制。

四鹽酸精胺屬于多胺類NO供體，在細(xì)胞增殖和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有著重要作用[17]。在本實(shí)驗(yàn)中加入四鹽酸精胺后，A、B、C、D、E組相較于PBS對照組，血小板NO濃度均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。四鹽酸精胺的濃度越高，產(chǎn)生的NO的量越多，不同濃度組間NO濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），50 mmol/L時(shí)產(chǎn)生的NO最多。這說明NO供體四鹽酸精胺能夠在體外向血小板提供一定量的NO，并且與四鹽酸精胺濃度有關(guān)，使其應(yīng)用于血小板儲存期間的生理調(diào)節(jié)。目前，NO供體在血小板儲存中的運(yùn)用也已開展多項(xiàng)研究得到證實(shí)[14]。額外添加適量的NO供體后，會產(chǎn)生更多的NO作用于血小板參與后續(xù)的抑制級聯(lián)反應(yīng)，從而改善儲存期間血小板的保存質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)在加入NO供體四鹽酸精胺后，血小板CD62p的表達(dá)相較于PBS對照組明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即這種NO供體可以抑制血小板的活化。從不同濃度的組別來看，CD62p的受抑制程度與四鹽酸精胺的濃度有關(guān)，隨著四鹽酸精胺濃度增加，血小板CD62p表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在約30 mmol/L后CD62p表達(dá)趨于穩(wěn)定。這表明四鹽酸精胺對血小板活化的抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)隨著濃度的升高逐漸增強(qiáng)，超過一定濃度后抑制作用保持穩(wěn)定。因此，濃度30 mmol/L左右可能是四鹽酸精胺抑制血小板活化作用的最佳濃度。

血小板膜表面CD62p的表達(dá)率會影響血小板輸注效果，CD62p表達(dá)率越高，血小板校正增加值（corrected count increment，CCI）越低，臨床的輸注效果越差[15]。因此，我們在用四鹽酸精胺這種NO供體處理血小板制品后，可以一定程度上抑制血小板CD62p的表達(dá)，預(yù)測在臨床輸注這樣處理后的血小板，可以降低輸血并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，使臨床血小板輸注更為安全有效。

綜上所述，四鹽酸精胺能夠在體外向血小板提供外源性的NO，從一定程度上抑制血小板CD62p的表達(dá)，并且這一現(xiàn)象與四鹽酸精胺的濃度有一定的關(guān)系。我們的研究結(jié)果顯示當(dāng)NO濃度上升到一定程度后血小板CD62p的表達(dá)不受NO濃度變化的影響。過高濃度的NO供體使NO過量地釋放，這可能導(dǎo)致由NO/cGMP途徑引發(fā)的抑制信號級聯(lián)反應(yīng)的非生理性過度刺激從而其抑制作用有所減弱，也可能是存在除了NO/cGMP途徑之外的其他對血小板有作用的途徑導(dǎo)致其抑制血小板活化效果穩(wěn)定。下一步可以從濃度、時(shí)間和檢測指標(biāo)上對先前的實(shí)驗(yàn)做出優(yōu)化和補(bǔ)充，更深程度上研究探討NO供體四鹽酸精胺對血小板保存期質(zhì)量的影響及其相關(guān)作用機(jī)制。在保證四鹽酸精胺作用的安全性和有效性后，可以將其制備成一種血小板保存液添加劑，以提升存儲期血小板的質(zhì)量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突