肖勇 賀海東 胡屏 孫蔚倩 徐旭東 唐余燕

以呼吸道或消化道感染后出現(xiàn)肉眼血尿為特征的免疫球蛋白A（IgA）腎?。↖gAN），是最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，常見于20～40歲的年輕人。并且20%～40%的IgAN患者會在發(fā)病20年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎病[1]。盡管人們對IgA腎病的發(fā)病機(jī)制有了更深入的了解，治療方法也有所改進(jìn)，但I(xiàn)gAN仍然是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。目前，IgAN的診斷只能通過有創(chuàng)性腎活檢病理檢查來確診。此外，其相應(yīng)的治療主要依賴于腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的非特異性抑制劑和免疫抑制劑，但治療效果不理想。

IgAN病理特征在于半乳糖缺陷型IgA1（GdgA1）廣泛沉積于腎小球系膜，然而含有l(wèi)gA的沉積物的增殖和最終導(dǎo)致腎小球損傷的確切機(jī)制尚不清楚。據(jù)報道，與健康對照組相比，IgAN患者的血清IgA和Gd-IgA1水平升高[2]。IgA1的不完全糖基化也被證明為進(jìn)一步起到自身抗原的作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體[3]。在IgA受體的協(xié)助下，這些含有Gd-IgA1的免疫復(fù)合物（IC）在腎小球系膜沉積，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子和趨化因子的過度產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腎小球損傷[4]。然而，關(guān)于IgAN的病因和發(fā)病機(jī)制仍存在一些爭議。有研究表明，選擇性IgA1的高應(yīng)答性在IgAN的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

然而，Gd-IgA1的準(zhǔn)確表達(dá)位置仍然存在爭議。最近的研究表明，腸道微生物群的改變對宿主免疫反應(yīng)具有很大影響，會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生或進(jìn)展[5]。先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)分別在宿主和腸道微生物群之間形成生化屏障。然而，在屏障被打破的情況下，可能會發(fā)生菌群失調(diào)，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。同時，腸道微生物的改變可增加抗原載量和上皮TLR的識別性，從而促進(jìn)B細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)換和IgA的過度產(chǎn)生[5]。這意味著穩(wěn)定微生物可能會轉(zhuǎn)變?yōu)槟c道菌群失調(diào)，包括非主要菌群或潛在有害細(xì)菌的過度生長[6]。持續(xù)的抗原侵襲也可能導(dǎo)致腸道通透性、亞臨床炎癥狀態(tài)或黏膜相關(guān)淋巴組織激活的改變[7]。我們前期研究表明IgAN患者血清Gd-IgA1水平較正常組及疾病對照組升高，與患者的24 h尿蛋白定量、腎臟損傷程度呈正相關(guān)[8]。因此本研究旨在探討腸黏膜屏障功能與血清Gd-IgA1表達(dá)水平的相關(guān)性，為臨床指導(dǎo)IgAN的診斷與治療提供新的思路。

對象與方法

1 對象 前瞻性收集2019年1月～2019年12月我科住院病人，入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次經(jīng)我科腎活檢病理證實(shí)為IgAN患者，45例作為實(shí)驗組；（2）年齡≥18歲，既往未接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或腎移植治療；（3）排除合并感染、腫瘤、妊娠等情況；腎小球濾過率（eGFR）均≥50 mL·min-1·（1.73 m2）-1。我院體檢中心正常健康對照組25例。所有標(biāo)本均已獲得受試者知情同意，并得到閔行區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（批件號：2018-010-01K）。收集上述兩組外周血5 mL，離心并收集血清，檢測所有血清樣本中腸黏膜屏障損傷指標(biāo)（細(xì)胞黏附分子（ICAM）、D-乳酸（D-LAC）、脂多糖（LPS）、二胺氧化酶（DAO））、炎癥因子（白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α））及Gd-IgA1水平，同時收集患者的一般資料及臨床指標(biāo)（腎功能、24 h尿蛋白定量及IgA水平），并將上述指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 方法

2.1 主要試劑：患者腎功能、24 h尿蛋白定量、IgA水平為患者住院期間本院檢驗科檢測，同時使用人半乳糖缺乏IgA1（Gd-IgA1）特異性抗體KM55酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒檢測血清Gd-IgA1，購自日本IBL公司，批號（Lot No）2E-117，貨號（Code No）27600。DAO（cat. no. SDH0135）、D-LAC（cat. no. SDH0134）、sICAM-1（cat. no. SDH0131）及 LPS（cat. no. SDH0133） 、TNF-α（cat. no. SDH0001）及IL-6 （cat. no. SDH0021）ELISA檢測試劑盒均購置上海司鼎生物科技有限公司。

2.2 收集標(biāo)本：所有慢性腎炎患者，活檢當(dāng)日清晨空腹采血5 mL，即時分離血清，吸入1.5 mL EP管，分裝3管，貼好標(biāo)簽，放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩５怯浕颊咝畔ⅲ_診IgAN的患者取出標(biāo)本用于后續(xù)試驗。

2.3 ELISA檢測：樣本為上述制備的外周血血清；依據(jù)試劑盒說明書檢測。

2.4 相關(guān)性分析：通過pearson相關(guān)性分析對IgAN患者腸黏膜屏障損傷指標(biāo)（DAO、D-LAC、sICAM-1及 LPS）與血清Gd-IgA1水平進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graph Pad Prism5.0及SPSS 22.0軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（最小值-最大值）表示，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用t檢驗，性別分布分析采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用pearson分析方法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組的一般資料 兩組在性別比例及年齡組成上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而與對照組相比，IgA腎病組血清肌酐（Scr）及Gd-IgA1水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1 。

表1 實(shí)驗組及對照組的一般資料

2 兩組血清Gd-IgA1水平比較 根據(jù)文獻(xiàn)，采用KM55 ELISA試劑盒檢測兩組血清樣本Gd-IgA1水平[9]，與對照組（3.81±1.03）mg/L相比，IgAN患者Gd-IgA1（9.36±3.43）mg/L水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.94，P＜0.000 1），見圖1。

圖1 兩組血清Gd-IgA1水平比較

3 兩組血清炎癥因子水平比較 為了探討IgA腎病患者Gd-IgA1水平升高機(jī)制，我們進(jìn)一步采用ELISA試劑盒，檢測兩組血清樣本炎癥因子（IL-6及TNF-α）水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IgAN患者TNF-α（242.6±167.1）pg/mL水平比對照組（116.9±32.81）pg/mL升高，同時，IgAN患者組IL-6（44.13±24.47）pg/mL比對照組 （30.16±12.46） pg/mL水平升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.78，P=0.007 3；t=2.30，P=0.027），見圖2。提示IgAN患者處于微炎癥狀態(tài)。

圖2 兩組血清炎癥因子水平比較

4 兩組腸黏膜屏障損傷指標(biāo)水平比較 為了探討IgAN患者微炎癥狀態(tài)及Gd-IgA1產(chǎn)生機(jī)制，我們檢測了IgAN患者外周血清腸黏膜屏障損傷指標(biāo)（DAO、D-LAC、sICAM-1及 LPS）水平，與對照組相比（186.1±33.35）U/mL ，IgAN患者DAO（230±65.16）U/mL表達(dá)水平升高（t=2.527，P=0.015）；IgAN患者D-LAC（0.67±0.45）mmol/L水平也比對照組（0.45±0.09）mmol/L高（t=2.152，P=0.035）；并且IgAN患者sICAM-1表達(dá)水平（1 052±154.4）ng/mL比對照組（822.5±96.23）ng/mL升高（t=6.025，P＜0.0001）；LPS水平與對照組相比（1 357±330）pg/mL，IgAN患者（1 567±377）表達(dá)升高（t=2.045，P=0.045），見圖3。提示IgAN患者腸道黏膜屏障功能受損，與IgAN患者微炎癥狀態(tài)及Gd-IgA1產(chǎn)生增多相關(guān)。

圖3 兩組腸黏膜屏障損傷指標(biāo)水平比較

5 血清Gd-IgA1與腸黏膜屏障損傷指標(biāo)的關(guān)系 為了進(jìn)一步分析Gd-IgA1產(chǎn)生機(jī)制，通過相關(guān)性分析IgAN患者血清Gd-IgA1水平及腸黏膜屏障損傷指標(biāo)（DAO、D-LAC、sICAM-1及 LPS）水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgAN患者Gd-IgA1水平與腸道屏障損傷指標(biāo)呈正相關(guān)（P＜0.05），見圖4，提示Gd-IgA1表達(dá)水平與腸道屏障功能受損相關(guān)。

圖4 血清Gd-IgA1與腸黏膜屏障損傷指標(biāo)的關(guān)系

討 論

腸道微生物及其衍生代謝物已被認(rèn)為對免疫穩(wěn)態(tài)有重大影響[10]。據(jù)估計，腸道內(nèi)有多達(dá)100萬億個微生物[11]。這些腸道微生物維持上皮屏障的完整性，塑造了腸道免疫系統(tǒng)，通過微生物代謝物、組成和對宿主細(xì)胞的附著來平衡宿主防御[12]。同時，腸黏膜包含大量不同的免疫細(xì)胞，它們參與維持健康的腸道微生物，并增強(qiáng)上皮屏障功能[13]。越來越多的證據(jù)支持腸道微生物群在宿主免疫反應(yīng)中作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)元件的重要作用。已知腸上皮細(xì)胞能夠表達(dá)不同的模式識別受體，如Toll樣受體（TLR）和NOD樣受體（NLR），用于免疫監(jiān)測。研究表明，它們能感知細(xì)菌成分，誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、抗菌肽和粘液[14]。例如，已觀察到革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜脂多糖（LPS）在培養(yǎng)的IgAN外周血B淋巴細(xì)胞中具有激活TLR4的能力。LPS顯示出強(qiáng)烈抑制核心β1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶特異性分子伴侶（Cosmc）mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致聚合Gd-IgA1的過度產(chǎn)生[14]。來自侵襲性病原體的鞭毛蛋白被認(rèn)為是通過腸道固有層中TLR-5+CD11+的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致小鼠IgA升高[15]。尿毒癥毒素，如吲哚硫酸鹽、對甲酚硫酸鹽、吲哚-3乙酸、三甲胺N-氧化物和苯乙酰谷氨酰胺，也被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-12的釋放，導(dǎo)致腸道炎癥和免疫球蛋白A的過度產(chǎn)生。硫酸吲哚通過干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF1）-線粒體動力相關(guān)蛋白1（DRP1）（IRF1-DRP1）軸介導(dǎo)的線粒體吞噬功能損傷來誘導(dǎo)腸屏障損傷。降低吲哚硫酸濃度或針對IRF1-DRP1軸可能是緩解慢性腎臟疾病相關(guān)腸道功能障礙的有前景的治療策略[16]。

腸黏膜屏障功能在慢性腎臟病發(fā)生及發(fā)展中的作用日益受到人們的重視。腸道微生物群的改變可能會影響全身或局部免疫反應(yīng)。正常情況下，宿主給微生物提供了一個平衡的免疫系統(tǒng)，宿主和腸道微生物群保持動態(tài)平衡。先天免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)分別在宿主和腸道微生物群之間形成生化屏障。然而，在屏障被打破的情況下，可能會發(fā)生菌群失調(diào)，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。異常的免疫反應(yīng)已被證明會導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的浸潤增加，如中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、Th1或Th17細(xì)胞[17]。同時，腸道微生物的改變可增加抗原載量和上皮TLR的識別性，從而促進(jìn)B細(xì)胞的分類轉(zhuǎn)換和IgA的過度產(chǎn)生[18]。因此腸道黏膜屏障功能受損可能參與Gd-IgA1產(chǎn)生。

我們可以通過評估IgAN患者腸道黏膜屏障功能來研究Gd-IgA1產(chǎn)生機(jī)制，而檢測腸道屏障功能的狀況是診斷腸道屏障功能受損的重要依據(jù)。但目前直接觀察腸道屏障功能仍較困難，多通過檢測細(xì)胞黏附分子（ICAM）、D-乳酸（D-LAC）、LPS、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）間接反映腸黏膜的屏障功能。DAO是腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞漿中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)腸黏膜上皮細(xì)胞受到損傷后，胞內(nèi)釋放DAO增加，進(jìn)入腸細(xì)胞間隙、淋巴管和血流，使血漿DAO升高，外周血中DAO活性穩(wěn)定。因此，血DAO活性可反映腸道損傷和修復(fù)情況[19]。D-乳酸是胃腸道固有細(xì)菌的代謝終產(chǎn)物，腸道多種細(xì)菌均可產(chǎn)生。因哺乳動物體內(nèi)不具備將其快速代謝分解的酶系統(tǒng)，在腸黏膜受損和腸黏膜通透性增加時，腸道中細(xì)菌產(chǎn)生的D-乳酸通過受損腸黏膜經(jīng)循環(huán)入血，可見血中D-乳酸水平升高。因此檢測其外周血水平即可反映腸道損傷和修復(fù)情況[20]。白細(xì)胞的過度激活是炎癥性腸病病理過程中的一個重要環(huán)節(jié)。白細(xì)胞停滯并浸潤式的血管外滲依賴于炎癥部位白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的黏附分子（intercellular adhesion molecule ICAM）的表達(dá)與功能。其中ICAM-1 屬于免疫球蛋白超家族，在炎癥性腸病發(fā)病中的作用近年來受到關(guān)注。正常腸組織ICAM-1 通常低水平表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、腸黏膜固有層和淋巴結(jié)中的單核巨噬細(xì)胞。在IBD腸組織中，I-CAM-1 表達(dá)和分布明顯增加，且與組織的炎癥程度密切相關(guān)[21-22]。因此，檢測血清sICAM-l 的水平可能成為監(jiān)測腸道黏膜功能狀態(tài)的重要指標(biāo)[23]。

本研究通過對45例IgAN患者及健康組25例進(jìn)行血清炎癥因子，可溶性細(xì)胞間黏附分子-l （sICAM-1），D-乳酸（D-LAC）、DAO和LPS定量測定，評價其在IgAN患者中的變化及其臨床意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgA腎臟患者外周血清炎癥因子（TNF-α及IL-6）較對照組升高，腸黏膜屏障損傷指標(biāo)（D-LAC 、DAO、sICAM-1及 LPS）水平也較對照組升高，提示IgAN患者腸道黏膜屏障功能受損。我們前期研究表明IgAN患者血清Gd-IgA1水平較正常組及疾病對照組升高，與患者的24 h尿蛋白定量、腎臟損傷程度呈正相關(guān)[8]。因此我們進(jìn)一步分析腸黏膜屏障損傷指標(biāo)與Gd-IgA1水平相關(guān)性，結(jié)果表明D-LAC 、DAO、sICAM-1及 LPS水平與Gd-IgA1水平呈正相關(guān)，提示腸道屏障功能受損，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，從而誘導(dǎo)Gd-IgA1產(chǎn)生增多，最終導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)IgA1沉積及腎炎發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗證實(shí)了IgAN患者Gd-IgA1及炎癥因子表達(dá)升高，可能與IgAN患者腸道黏膜屏障受損相關(guān)，這為改善IgAN的治療監(jiān)測及判斷預(yù)后開拓新方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突