楊慕坤 王子君 崔廣霞 陳麟鳳 白文佩

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA），又稱Asherman綜合征，是一種子宮內(nèi)膜基底層損傷后肌壁發(fā)生相互黏附，進(jìn)而導(dǎo)致宮腔部分或全部閉塞的婦科疾病[1]。臨床常表現(xiàn)為月經(jīng)減少、閉經(jīng)或周期性下腹痛等，導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)、不孕，嚴(yán)重危害女性生育功能。宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)（transcervical resection of adhesion，TCRA）是目前治療宮腔粘連的標(biāo)準(zhǔn)手段，可有效松解纖維性粘連組織，恢復(fù)宮腔正常形態(tài)。但TCRA術(shù)后再粘連率高達(dá)62.50%，且往往更易發(fā)生妊娠并發(fā)癥和不良妊娠結(jié)局[1-2]。

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是自體的新型血小板濃縮物[3]，含有高濃度血小板、多種細(xì)胞因子、大量纖維蛋白等，是一種富含生物活性的支架材料，可在細(xì)胞生長、增殖、分化和血管生成中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。自2006年CHOUKROUN首次報(bào)道PRF以來[3]，PRF已逐漸應(yīng)用于促進(jìn)牙槽骨再生、治療頜骨壞死、修復(fù)外傷性鼓膜穿孔、難愈性創(chuàng)面和潰瘍等領(lǐng)域中[4-7]。在本課題組前期的隨機(jī)對(duì)照研究中，40例宮腔粘連合并不孕癥患者，使用PRF治療后宮腔粘連評(píng)分顯著下降（PRF組治療前：9.00分；治療后：2.00分；P＜0.01），妊娠率明顯提高（PRF組：55%；對(duì)照組：20%；P＜0.05）[8]。但目前尚無針對(duì)PRF對(duì)子宮內(nèi)膜的形態(tài)學(xué)影響的研究，且PRF促進(jìn)內(nèi)膜修復(fù)，預(yù)防宮腔粘連的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬探討PRF對(duì)IUA患者子宮內(nèi)膜的修復(fù)影響。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 2018年10月～2020年9月，對(duì)就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院的宮腔粘連患者進(jìn)行招募，符合納入排除標(biāo)準(zhǔn)的患者在自愿簽署知情同意書后進(jìn)入研究流程。本項(xiàng)研究已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)：2018倫審新技術(shù)第39號(hào)），并在中國臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心注冊(cè)（http：//www.chictr.org.cn，注冊(cè)號(hào)為1900021518）。

1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：18～40歲女性；經(jīng)宮腔鏡檢查確診宮腔粘連；有生育需求，正常性生活≥1年，未避孕未孕。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常；血液學(xué)或免疫學(xué)疾?。淮嬖趯m腔鏡檢查禁忌證；存在妊娠禁忌證；婦科惡性腫瘤病史；3個(gè)月內(nèi)曾接受藥物或手術(shù)方案治療宮腔粘連；存在其他可能導(dǎo)致不孕的因素（如：男方因素；生殖道畸形；雙側(cè)輸卵管梗阻或缺失；卵巢儲(chǔ)備功能下降、排卵障礙或下丘腦性閉經(jīng)；不明原因陰道不規(guī)則出血；合并其他婦科疾?。鹤訉m肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥等）。

2 方法

2.1 患者分組：SPSS 26.0軟件生成隨機(jī)數(shù)字表，將隨機(jī)數(shù)字與組別裝入不透光的牛皮紙信封中并密封，研究者根據(jù)入組順序開啟信封，確定患者的分組情況（PRF組或?qū)φ战M）。

2.2 PRF制備：輸血科根據(jù)Choukroun的方案[3]進(jìn)行PRF的制備，患者術(shù)前1～2 h采血20 mL置于不含抗凝劑的真空采血管中，在常溫下以400 g的離心力離心10 min，靜置10 min后即可。見圖1。

圖1 富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）大體外觀

2.3 宮腔鏡操作步驟及PRF置入：兩組患者均實(shí)施宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)，恢復(fù)宮腔解剖學(xué)形態(tài)，在粘連部位留取子宮內(nèi)膜組織用于形態(tài)學(xué)評(píng)估。PRF組在最后將PRF置入宮腔，對(duì)照組宮腔內(nèi)不放置任何藥物及材料。4周后，PRF組再次宮腔內(nèi)放置PRF，不進(jìn)行宮腔鏡手術(shù)。8周后兩組患者均行宮腔鏡二探術(shù)，評(píng)估粘連情況和宮腔形態(tài)，若發(fā)現(xiàn)再粘連形成，則再次行粘連松解，在前次留取子宮內(nèi)膜組織的相同部位鉗取部分子宮內(nèi)膜組織。研究流程如圖2所示。

圖2 研究流程圖

2.4 子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)評(píng)估：所有留取的子宮內(nèi)膜組織用4%多聚甲醛固定后制作成石蠟切片或冰凍切片，行HE染色、免疫熒光組織染色及Masson染色，通過 Image pro plus 7.0 軟件進(jìn)行圖像分析。觀察指標(biāo)如下：

HE染色：光學(xué)顯微鏡下在每張HE染色切片中隨機(jī)選取4個(gè)低倍鏡（200×：物鏡為20×，目鏡為10×）視野，計(jì)算4個(gè)切面腺體數(shù)量的平均值，作為子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量。

免疫熒光化學(xué)染色：使用Ki67、CK-18、波形蛋白Vimentin染色以評(píng)價(jià)治療前后子宮內(nèi)膜分子的變化。在倒置相差熒光顯微鏡下隨機(jī)選取每張切片的4個(gè)視野（400×：物鏡為40×，目鏡為10×），平均熒光強(qiáng)度=該區(qū)域熒光強(qiáng)度總和/該區(qū)域面積。

Masson染色：在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取每張切片的4個(gè)低倍鏡（200×：物鏡為20×，目鏡為10×）視野，測量膠原纖維區(qū)域（呈藍(lán)色）的面積與子宮內(nèi)膜區(qū)域面積的比值，計(jì)算4個(gè)視野的平均值，作為子宮內(nèi)膜纖維化面積的比率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析選用SPSS 26.0軟件。子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量、纖維化面積等計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行前后比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 研究對(duì)象臨床信息 研究期間共計(jì)招募81例宮腔粘連患者進(jìn)入此次臨床試驗(yàn)。其中，13例患者被排除（11例患者符合排除條件，2例患者拒絕參加），最終68例患者（PRF組34例，對(duì)照組34例）納入研究。所有納入研究患者均簽署了知情同意書。

入組患者的年齡、身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、孕產(chǎn)次、宮腔操作史、不孕年限、月經(jīng)情況、粘連評(píng)分等基線數(shù)據(jù)比較差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。本研究最終納入62例患者完成全部研究和隨訪，脫落率為8.82%（6/68），其中PRF組31例，對(duì)照組31例。

表1 研究對(duì)象臨床信息總結(jié)（n=68）

2 子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué) PRF組患者子宮內(nèi)膜組織治療后出現(xiàn)完整的腺體和致密的間質(zhì)細(xì)胞，腺體數(shù)量較前明顯增加，Ki67、CK-18和波形蛋白Vimentin表達(dá)量明顯增多，纖維化面積比例減少（P＜0.05）。對(duì)照組腺體數(shù)量、Ki67、CK-18表達(dá)量均有所增多但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），波形蛋白Vimentin和纖維化面積比例均增加（P＜0.05）。

治療前，HE結(jié)果和Masson結(jié)果顯示PRF組和對(duì)照組患者損傷的子宮內(nèi)膜幾乎沒有完整的腺體和間質(zhì)結(jié)構(gòu)，而代之以大量膠原纖維。反映增殖分化的指標(biāo)Ki67、CK-18和波形蛋白Vimentin免疫熒光染色顯色顯示散在分布，在內(nèi)膜中表達(dá)量較低（見圖3）。治療后PRF組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量、Ki67平均熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；纖維化面積比例小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；CK-18、波形蛋白Vimentin平均熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見表2）。

表2 子宮內(nèi)膜增殖分化功能情況（n=62）

圖3 子宮內(nèi)膜治療前后HE、免疫熒光和Masson染色

討 論

本研究中對(duì)照組患者術(shù)后子宮內(nèi)膜纖維化面積有所增加，這提示TCRA后子宮內(nèi)膜修復(fù)尚不理想。宮腔粘連患者基底層受損，局部內(nèi)膜再生功能顯著下降[9]；殘余子宮內(nèi)膜組織往往血管生成不良，血流灌注較差；內(nèi)膜的修復(fù)過程緩慢，在粘連分離初期缺乏天然屏障防止再粘連形成；手術(shù)機(jī)械操作導(dǎo)致炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子聚集，纖維增生活躍[9-11]，暴露的創(chuàng)面極有可能發(fā)生再次粘連。

目前促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)的藥物研究多集中于雌激素、阿司匹林、硝酸甘油、枸櫞酸西地那非、中醫(yī)藥等[1]，但缺乏對(duì)妊娠率改善的明確證據(jù)，且藥物劑量、給藥途徑等尚未達(dá)成共識(shí)，仍需要更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。不同規(guī)格的屏障式或支撐式防粘連器具[1]也常用于宮腔粘連分離術(shù)后隔離手術(shù)創(chuàng)面。一項(xiàng)比較宮腔粘連分離術(shù)后預(yù)防措施的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)（分為空白對(duì)照組、放置宮內(nèi)節(jié)育器組、雌孕激素組和放置宮內(nèi)節(jié)育器＋雌孕激素組，共4組，n=25），4組術(shù)后粘連率及妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12]。近年來，羊膜[13]、骨髓單核細(xì)胞[14]和干細(xì)胞[14]等新型生物材料在促進(jìn)內(nèi)膜修復(fù)方面的應(yīng)用越來越受到大家的關(guān)注，但倫理和安全性等問題是其廣泛應(yīng)用的瓶頸。二次宮腔鏡探查也可以作為減少宮腔粘連再復(fù)發(fā)的措施之一[15]，有臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在宮腔鏡術(shù)后早期進(jìn)行二次宮腔鏡探查，可以在新形成的粘連變得致密之前進(jìn)行再次松解，有效性可以達(dá)到80%以上[16-17]。但是二次宮腔鏡探查后仍存在需要再次宮腔鏡手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，隨著宮腔鏡手術(shù)次數(shù)的增加，宮腔鏡相關(guān)并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)有上升的可能[15]。所以，目前還沒有公認(rèn)的措施可以作為宮腔鏡宮腔粘連分離術(shù)術(shù)后的輔助治療方式。基于上述研究結(jié)果，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)照組在完成宮腔鏡粘連分離手術(shù)后，宮腔內(nèi)不放置任何藥物及材料，僅在術(shù)后8周行二次宮腔鏡探查，分離新形成的粘連。

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成是子宮內(nèi)膜損傷后再生的關(guān)鍵，PRF作為多種生長因子的集合體，能夠緩釋包括IGF、EGF、PDGF等在內(nèi)的大量生長因子，生長因子可能作為重要介質(zhì)加速了PRF作用下?lián)p傷內(nèi)膜組織的愈合與再生[18]。本研究結(jié)果提示，宮內(nèi)置入PRF可以促進(jìn)宮腔粘連受損內(nèi)膜的再生，PRF組腺體數(shù)量、Ki67、CK-18、波形蛋白Vimentin平均熒光強(qiáng)度在治療前后均明顯增加（P＜0.05），提示PRF能促進(jìn)子宮內(nèi)膜增殖分化，再生的子宮內(nèi)膜具有正常的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的克隆形成、遷移、血管生成和免疫抑制能力均明顯低于健康女性[19]，PRF組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物波形蛋白Vimentin表達(dá)增加，提示PRF同樣具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞增殖的作用，有利于子宮內(nèi)膜的再生修復(fù)。

有研究認(rèn)為宮腔粘連的發(fā)生機(jī)制與炎癥有關(guān)，炎癥因子干擾損傷內(nèi)膜的修復(fù)，影響子宮內(nèi)膜干細(xì)胞功能，限制組織再生修復(fù)能力[20]。血小板能夠通過調(diào)節(jié)外周血單核細(xì)胞上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)，抑制促炎因子的產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)抗炎作用[21]。BURNOUF在體外實(shí)驗(yàn)觀察到富有白細(xì)胞的富血小板纖維蛋白[22]有對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抗菌活性。由此推測，PRF作為血小板濃縮物也具有一定的抗菌抑炎特性，可以降低宮腔術(shù)后炎癥反應(yīng)。

嵌在PRF支架中的白細(xì)胞在傷口愈合過程中的細(xì)胞因子釋放、免疫調(diào)節(jié)、抗菌反應(yīng)和基質(zhì)重塑中也發(fā)揮了一定的作用。DOHAN DM等[3]通過定量計(jì)算PRF析出液中的免疫因子，其中包括重要的抑炎因子IL-4和血管內(nèi)皮生長因子VEGF，考慮PRF中的白細(xì)胞可能通過分泌細(xì)胞因子的方式調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程。根據(jù)NASIRZADE的報(bào)道[23]，PRF可以通過抑制脂多糖和唾液誘導(dǎo)的原代和RAW264.7巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1β和IL-6的表達(dá)，從而進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)促炎性M1型巨噬細(xì)胞向免疫調(diào)節(jié)性M2型巨噬細(xì)胞的極化。在我們前期針對(duì)薄型子宮內(nèi)膜大鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，mRNA水平的分析結(jié)果顯示，與病例組相比，PRF組促炎因子IL-1β表達(dá)明顯下調(diào)，抗纖維化重要成分MMP-9表達(dá)明顯上調(diào)[24]，這表明PRF具有抗炎和抗纖維化作用。同時(shí)，PRF組內(nèi)IL-6表達(dá)明顯上調(diào)，可以發(fā)揮刺激和動(dòng)員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用，有助于子宮內(nèi)膜的增殖再生。

PRF肉眼觀察為淡黃色凝膠，在掃描電鏡下呈現(xiàn)出以纖維蛋白為骨架的三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[25]，等邊連接的方式尤其有利于子宮內(nèi)膜的移行再生，可作為新生細(xì)胞遷移爬行的生物活性支架[26]。子宮內(nèi)膜局部纖維增生，瘢痕形成是宮腔粘連的重要形態(tài)學(xué)改變，本研究中，PRF組的纖維化面積比例在治療后明顯降低（P＜0.05），有利于宮腔形態(tài)維持，減少瘢痕形成。還有研究發(fā)現(xiàn)PRF可增加基質(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metallopeptidase-9，MMP-9）在人骨髓細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化活性[18]，說明PRF還可能通過抗纖維化的通路協(xié)助子宮內(nèi)膜修復(fù)。但PRF在子宮內(nèi)膜修復(fù)中抗纖維化的具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的證據(jù)證明。

本研究結(jié)果表明，宮腔粘連分離術(shù)聯(lián)合宮內(nèi)置入 PRF可以促進(jìn)宮腔粘連損傷子宮內(nèi)膜的再生修復(fù)。這一發(fā)現(xiàn)為宮腔粘連的綜合治療提供了一個(gè)嶄新的視角和思路，有望成為輔助治療的新選擇。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突