李杰，左想想，張南茜，劉江齊，朱艷平，劉耀

1.河南科技大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.南召縣林業(yè)局，河南 南陽 474650

紅景天為景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola roseaL.）多年草本或亞灌木野生植物，主要以莖和根入藥。其性平，味甘、微苦，具有益氣活血、通脈平喘的功效，常用于氣虛血瘀、胸痹心痛、卒中偏癱等[1]。近代研究表明，紅景天苷和酪醇是紅景天的主要活性組分，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制癌細(xì)胞生長、防止肝纖維化等藥理作用[2-4]，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、保健、食品等領(lǐng)域。目前常用甲醇或乙醇提取紅景天苷和酪醇，甲醇或乙醇為提取溶劑存在著易燃、易爆、易揮發(fā)、溶劑殘留等問題。因此需要一種綠色高效的提取溶劑來提取紅景天苷和酪醇。

低共熔溶劑（DESs）是由Abbott 等[5]合成的一種新型綠色溶劑，主要由氫鍵受體和氫鍵給體兩類化合物組成，具有廉價(jià)易得、難揮發(fā)、無毒、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，是傳統(tǒng)溶劑的良好替代品[6-7]。吳蓉等[8]以乙酰丙酸-乙二醇（1∶1）組成的DESs提取紅景天苷和酪醇，結(jié)果表明，在攪拌速率為150 r·min–1，料液比為1.0∶2.5，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為65 min 時(shí)，紅景天苷和酪醇的提取率最佳，分別是同等條件下水和乙醇提取率的1.2、1.1 倍。但其提取時(shí)間長，同時(shí)以價(jià)格昂貴的乙酰丙酸為氫鍵受體，提取成本高，因此有必要對該提取方法進(jìn)行改進(jìn)和完善。氯化膽堿是一種應(yīng)用廣泛的氫鍵受體，具有廉價(jià)易得、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。Ali 等[9]以氯化膽堿為氫鍵受體，蘋果酸、草酸、對甲基苯磺酸等為氫鍵給體制備了11 種DESs，提取枸杞中的黃酮類化合物。結(jié)果表明，氯化膽堿-對甲基苯磺酸（1∶2）組成的DESs提取效果最佳。Zhou等[10]制備了以氯化膽堿、甜菜堿及L-脯氨酸為氫鍵受體的12 種DESs，用以提取桑葉中的酚酸類化合物。結(jié)果顯示，氯化膽堿為氫鍵受體，檸檬酸為氫鍵給體組成的DESs提取效果最佳，遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的甲醇提取和水提取。Zhang等[11]以氯化膽堿為氫鍵受體，草酸等為氫鍵給體制備了6種DESs，提取茯苓多糖。發(fā)現(xiàn)氯化膽堿-草酸（1∶2）組成的DESs，多糖提取率是傳統(tǒng)熱水提取率的8.6 倍。因此，本研究以氯化膽堿為氫鍵受體，丙三醇等為氫鍵給體，制備了一系列的DESs，并在超聲輔助的條件下提取紅景天中的紅景天苷和酪醇，同時(shí)運(yùn)用Box-Behnken 響應(yīng)面法對該提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為紅景天中紅景天苷和酪醇的快速高效提取提供一種新思路，同時(shí)為后期的紅景天苷和酪醇的性能研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

BT125D 型雙量程電子分析天平（德國多利斯公司）；CT14RD 型高速冷凍離心機(jī)、LC2000 型高效液相色譜儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；KQ2200DE 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-420型磁力攪拌恒溫水浴鍋（上海力辰儀器科技有限公司）。

1.2 試藥

對照品酪醇（批號：H23M10Z89089，純度≥98%）、紅景天苷（批號：C13J8Q39713，純度≥98%）、氯化膽堿（分析純）均購自上海源葉生物科技有限公司；尿素、丙三醇、乙二醇、1,2-丙二醇、丙二酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）均為分析純；甲醇（天津巴斯夫分析試劑有限公司，色譜純）。

紅景天飲片（批號：20200801174）購于洛陽市，經(jīng)河南科技大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院歐麗娜副教授鑒定為景天科薔薇紅景天Rhodiola roseaL.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Kromasil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2% 磷酸水（18∶82）；流速：0.8 mL·min–1；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：276 nm；柱溫為室溫。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取紅景天苷對照品12.0 mg和酪醇對照品10.0 mg 于燒杯內(nèi)，甲醇溶解后，分別定容于10 mL棕色量瓶內(nèi)。然后分別移取紅景天苷對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL和酪醇對照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，混合于10 mL棕色量瓶中。最后移取上述混合對照品溶液2.5 mL于5 mL量瓶中，18%甲醇定容，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得紅景天苷和酪醇的混合對照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件檢測，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。紅景天苷：Y=7 178.3X–26 588（r=0.999 6）；酪醇：Y=17 606X–29 055（r=0.999 7）。紅景天苷在24～120 μg·mL–1線性關(guān)系良好；酪醇在15.0～75.5 μg·mL–1線性關(guān)系良好。

2.3 DESs的制備

將氯化膽堿分別與丙三醇、尿素、乙二醇、1,2-丙二醇、丙二酸按表1 的摩爾比混合于具塞錐形瓶內(nèi)，在80 ℃水浴條件下攪拌至完全溶解，取出冷卻至室溫，備用。

表1 DESs種類及摩爾比

2.4 供試品溶液的制備

稱取紅景天粉末1.0 g于具塞錐形瓶中，按照一定的液料比加入不同含水量的DESs，室溫條件下超聲（200 W，20 kHz）提取一定時(shí)間后，移取提取液2 mL，10 000 r·min–1離心5 min（離心半徑為6.36 cm），取上清液1 mL于5 mL量瓶中，18%甲醇定容，0.45 μm微孔過濾器濾過，按2.1 項(xiàng)下色譜條件檢測紅景天苷和酪醇的含量。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以紅景天苷和酪醇的提取率為評價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法對超聲輔助DESs提取紅景天中紅景天苷和酪醇的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表2。

表2 紅景天中紅景天苷和酪醇提取工藝Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.6 紅景天苷和酪醇提取率的計(jì)算

根據(jù)樣品的紅景天苷和酪醇的平均峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式（1）和（2）計(jì)算紅景天苷和酪醇的提取率（Y）。

式中，N為提取液的稀釋倍數(shù)，V為提取液總體積，M為紅景天的質(zhì)量，A1為紅景天苷平均峰面積，A2為酪醇平均峰面積。

2.7 DESs組成的確立

將上述制備的5 種DESs 與水（4∶1），按照液料比為20∶1 加入紅景天藥材粉末，在室溫條件下提取20 min（圖1）。由圖1 可知，紅景天苷和酪醇的提取率與DESs 的組成有關(guān)，其中以尿素作為氫鍵給體的DESs 提取率最低；丙三醇與氯化膽堿組成的DESs 提取率最高。因此，本研究將以丙三醇和氯化膽堿組成的DESs 為提取溶劑，進(jìn)一步探討超聲輔助提取的最佳工藝條件。

圖1 DESs種類對提取率的影響

2.8 單因素試驗(yàn)

2.8.1 提取時(shí)間對紅景天苷和酪醇提取率的影響在含水量為20%，液料比為20∶1 的條件下，研究提取時(shí)間對紅景天苷和酪醇提取率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，紅景天苷和酪醇的提取率呈先升高后降低的趨勢，在提取時(shí)間為30 min 時(shí)，紅景天苷和酪醇的提取率最高。這可能是由于提取時(shí)間的延長，提高了植物細(xì)胞壁的破碎程度，有利于紅景天苷和酪醇的溶出，但提取時(shí)間過長導(dǎo)致紅景天苷和酪醇結(jié)構(gòu)被破壞，提取率降低[12]。因此，提取時(shí)間30 min較為合適。

圖2 提取時(shí)間對提取率的影響

2.8.2 含水量對紅景天苷和酪醇提取率的影響 在提取時(shí)間為30 min，液料比為20∶1的條件下，研究含水量對紅景天苷和酪醇提取率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3 可知，隨著含水量的增加，紅景天苷和酪醇的提取率先升高后降低。當(dāng)含水量為30%時(shí)，紅景天苷和酪醇的提取率最高。這是由于含水量的升高，降低了DESs 的黏度，黏度的降低有利于提高DESs的傳質(zhì)效率[13]，提高紅景天苷和酪醇在溶劑的擴(kuò)散系數(shù)。同時(shí)，含水量的升高提高了DESs的極性。紅景天苷和酪醇的極性較大，根據(jù)相似相溶原理，極性增大有利于紅景天苷和酪醇的溶解。當(dāng)含水量超過30%后，紅景天苷和酪醇的提取率開始逐漸降低。這可能是由于含水量的增加導(dǎo)致DESs分子間的氫鍵斷裂，超分子結(jié)構(gòu)消失，使得紅景天苷和酪醇的提取率逐漸降低[14-15]。

圖3 含水量對提取率的影響

2.8.3 液料比對紅景天苷和酪醇提取率的影響 在提取時(shí)間30 min，含水量為30%的條件下，研究液料比對紅景天苷和酪醇提取率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，隨著液料比的增加，紅景天苷和酪醇的提取率先增大后逐漸降低。這可能是由于液料比的升高使物料與溶劑接觸更加充分，促進(jìn)了紅景天苷和酪醇的溶出，因此提取率升高。但當(dāng)液料比超過40∶1 時(shí)，過多的提取溶劑削弱了超聲波的能量，使超聲波不能有效地破壞植物細(xì)胞壁[16-17]，導(dǎo)致紅景天苷和酪醇的溶出量減少，提取率降低。

圖4 液料比對提取率的影響

2.9 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化

2.9.1 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析 根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，以提取時(shí)間（A）、含水量（B）和液料比（C）為自變量，以紅景天苷提取率（Y1）為主，酪醇提取率（Y2）為輔，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果見表3。

表3 紅景天中紅景天苷和酪醇提取工藝Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6軟件對表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到二次回歸方程：Y1=–3.54+0.0301A+0.240B+0.406C+0.00268AB–0.00168AC–0.000 450BC–0.005 18A2–0.005 81B2–0.004 56C2；Y2=–3.19+0.0338A+0.191B+0.930C–0.000475AB+0.00180AC+0.00153BC–0.000125A2–0.00392B2–0.00260C2。

由表4 可知，回歸方程的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)極顯著，說明各因素對響應(yīng)值不是簡單的一次線性關(guān)系。該模型的P<0.000 1，表明建立的數(shù)學(xué)模型具有極顯著性，回歸方程能很好地模擬真實(shí)曲面，方法可靠；失擬項(xiàng)P=0.556 4>0.05 不顯著，說明該數(shù)學(xué)模型的擬合度較好[18]。模型中一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)A2、B2和C2對紅景天苷提取率的影響極顯著（P<0.001），交互項(xiàng)AB 紅景天苷提取率的影響非常顯著（P<0.01），交互項(xiàng)AC 紅景天苷提取率的影響顯著（P<0.05），模型復(fù)合相關(guān)系數(shù)（R2）=0.986 7、校正決定系數(shù)（R2Adj）=0.969 6，表明可用該數(shù)學(xué)模型和二次回歸方程來分析和預(yù)測紅景天苷的提取率[19]。由各因素的F值可知B>C>A，說明含水量對紅景天苷提取率的影響最大，其次為液料比，提取時(shí)間影響最小。由表5 的酪醇方差分析結(jié)果可知，建立的數(shù)學(xué)模型P=0.001 2<0.01，失擬項(xiàng)P=0.062 5>0.05 表明建立的數(shù)學(xué)模型達(dá)到非常顯著水平。一次項(xiàng)A、C和二次項(xiàng)C2酪醇提取率的影響非常顯著；交互項(xiàng)AC、BC 酪醇提取率的影響顯著。酪醇數(shù)學(xué)模型的R2和R2Adj分別為0.945 2、0.874 8。由各因素的F值可知，提取時(shí)間對酪醇的提取率影響最大，其次為液料比，含水量影響最小。

表4 紅景天苷提取率方差分析結(jié)果

表5 酪醇提取率方差分析結(jié)果

2.9.2 響應(yīng)曲面擬合及最優(yōu)條件確立 利用Design Expert 8.0.6 軟件得到紅景天苷和酪醇的響應(yīng)面圖（圖5）。由圖5 可知，紅景天苷和酪醇的響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，說明在選定的區(qū)域內(nèi)，紅景天苷和酪醇的提取率存在極大值。從圖5中可直觀地看出，含水量的曲面最為陡峭，對紅景天苷提取率的影響最大[20]，其次為液料比和提取時(shí)間，與方差分析結(jié)果吻合。響應(yīng)面在底面上的投影為等高線圖，等高線圖的形狀反映了兩因素交互作用對提取率的影響，圓形代表不顯著，橢圓代表影響顯著[21]。由圖5中的等高線圖可知，提取時(shí)間和含水量的等高線圖呈橢圓形，因此對紅景天苷的提取率的影響最為顯著。同理，由圖5 可知，提取時(shí)間對酪醇提取率影響最大，提取時(shí)間和液料比交互作用對酪醇提取率的影響最顯著。經(jīng)Design Expert 8.0.6 軟件優(yōu)選的紅景天苷最佳提取條件為提取時(shí)間29.64 min，含水量26.07%，液料比37.86∶1.00，理論提取率為11.74 mg·g–1。酪醇的最佳提取條件為提取時(shí)間36.26 min，含水量29.77%，液料比39.24∶1.00，理論提取率為2.08 mg·g–1。

圖5 提取時(shí)間、含水量及液料比對紅景天中紅景天苷和酪醇提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.9.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由于紅景天苷是紅景天的特征組分且含量較高，因此對優(yōu)化得到的紅景天苷提取條件進(jìn)行了驗(yàn)證。為了方便操作將紅景天苷提取的最佳條件修正為提取時(shí)間30 min，含水量26%，液料比38∶1，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在此條件下紅景天苷和酪醇的平均提取率分別為11.64、2.02 mg·g–1，與預(yù)測值基本相符。說明基于Box-Behnken 響應(yīng)面法建立的回歸方程和數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定可靠，優(yōu)選的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)際參考價(jià)值。

3 結(jié)論

近年來，應(yīng)用超聲輔助技術(shù)提取中藥材中活性組分受到了研究者的廣泛關(guān)注[22-23]。超聲輔助提取主要是利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及熱效應(yīng)，提高物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，促進(jìn)細(xì)胞壁的破裂，從而使細(xì)胞內(nèi)容物快速溶出，達(dá)到快速、高效提取的目的。因此，與傳統(tǒng)的熱回流提取、煎煮提取等方法相比，超聲輔助提取可有效保障活性組分從中藥材中快速溶出，同時(shí)避免了長時(shí)間加熱而導(dǎo)致失活。本研究以氯化膽堿為氫鍵受體，尿素、乙二醇、丙二酸、1,2-丙二醇、甘油為氫鍵給體，制備了5 種綠色環(huán)保的DESs。通過對比發(fā)現(xiàn)，在超聲輔助下氯化膽堿-丙三醇組成的DESs 提取紅景天苷和酪醇效果最佳。在此基礎(chǔ)上，采用設(shè)計(jì)方法簡單、可信度較高的Box-Behnken 設(shè)計(jì)對超聲輔助DESs 提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，建立了紅景天苷和酪醇與提取時(shí)間、含水量及液料比之間的多元數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)模型。確立了紅景天苷和酪醇提取的最佳工藝參數(shù)，即提取時(shí)間30 min，含水量26%，液料比38∶1，在此條件下紅景天苷和酪醇的提取率分別為11.64、2.02 mg·g–1，與數(shù)學(xué)模型預(yù)測值基本相符，表明建立的數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定、可靠，得到的最佳提取工藝條件具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可為紅景天苷和酪醇的快速高效提取提供參考，同時(shí)可為紅景天的質(zhì)量控制和綜合開發(fā)利用提供借鑒。