朱琳，侯麗華，劉亮亮，陳素娥

山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 晉中 030619

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于我國東北部，又稱“北五味子”，是臨床上常用的益氣生津、補(bǔ)腎寧心的傳統(tǒng)中藥[1]。五味子提取物的主要化學(xué)成分有木脂素、多糖、揮發(fā)油、有機(jī)酸等[2-5]，其中，木脂素是最主要的藥理活性成分，具有保護(hù)肝臟、延緩心肌和血管重構(gòu)、改善記憶及認(rèn)知障礙、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用[6-10]。目前，從五味子中分離得到木脂素類成分約50 個(gè)[2]，《中華人民共和國藥典》2020 年版規(guī)定，以五味子醇甲含量作為五味子藥材及飲片質(zhì)量控制的指標(biāo)。中藥成分復(fù)雜，其質(zhì)量還易受采收時(shí)間、加工方法、貯藏條件等因素的影響[11-12]，因此，1 個(gè)指標(biāo)不能全面反映五味子的質(zhì)量。藥材質(zhì)量的差異導(dǎo)致相關(guān)制劑的質(zhì)量與安全也難以保障，加強(qiáng)五味子質(zhì)量控制極其重要。

響應(yīng)曲面法是數(shù)學(xué)方法與統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的產(chǎn)物，是對感興趣的響應(yīng)受多個(gè)變量影響的問題進(jìn)行建模和分析，以達(dá)到優(yōu)化該響應(yīng)的目的[13-14]。響應(yīng)曲面法通過圖形技術(shù)將因素與響應(yīng)的函數(shù)關(guān)系顯示出來，以供研究者直觀地選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件。響應(yīng)曲面法比正交設(shè)計(jì)更簡單，比均勻設(shè)計(jì)更全面，可有效減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，縮短周期，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[15-16]。目前，尚未見有關(guān)五味子木脂素類成分提取工藝的研究報(bào)道。因此，本研究以五味子中8個(gè)木脂素類成分總含量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型及響應(yīng)面法分析五味子木脂素類成分提取工藝的影響因素及相互關(guān)系，并建立8 個(gè)木脂素類成分的高效液相色譜法（HPLC）含量測定方法，分析評價(jià)不同產(chǎn)地五味子藥材中木脂素類成分的含量差異，以期為五味子中木脂素類成分的提取工藝及五味子藥材與其相關(guān)制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；LK/CSJ-30 型超聲波清洗機(jī)（老肯醫(yī)療科技有限公司）；XSE204型萬分之一天平、XPE105型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SC-3610型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司）。

1.2 試藥

對照品五味子醇甲、五味子甲素（天津一方科技有限公司，批號分別為1506570、1506571）純度均≥98%；五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子乙素、五味子丙素（批號分別為CHB190212、CHB180223、CHB180223、CHB180223、CHB180126、CHB180129）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均≥98%；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)）；甲醇、磷酸（天津大茂化學(xué)試劑廠，色譜純）。

15 批五味子藥材均收集于吉林省延邊州和白山市，經(jīng)山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院生藥教研室楊翠玲副教授鑒定為五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)。產(chǎn)地信息見表1。

表1 15批五味子藥材產(chǎn)地

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent ZB-Extend C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.5%磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～30 min，46%～52%B；30～33 min，52%～65%B；33～45 min，65%～68%B；45～50 min，68%～90%B；50～53 min，90%～100%B）；流速為1 mL·min–1；檢測波長為220 nm；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為35 ℃。

2.2 對照品溶液制備

分別取對照品五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為1.051、0.992、0.928、1.033、0.950、0.993、1.002、1.045 mg·mL–1的對照品儲備液，再精密吸取對照品儲備液適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為420.40、99.20、74.24、30.99、76.00、79.44、160.32、20.90 μg·mL–1的混合對照品溶液，4 ℃下保存待用。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 查閱文獻(xiàn)和單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對五味子藥材超聲提取影響比較顯著的3 個(gè)因素分別為超聲時(shí)間（A）、甲醇體積分?jǐn)?shù)（B）和料液比（C）。

利用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以8個(gè)木脂素類成分總含量為響應(yīng)變量，A、B、C 為3個(gè)獨(dú)立變量，設(shè)計(jì)三因素三水平中心組合試驗(yàn)，因素水平見表2，Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表2 五味子提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

表3 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)優(yōu)化五味子提取工藝設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.2 回歸模型建立及顯著性檢驗(yàn) 通過Design Expert 11 軟件將獨(dú)立變量A、B、C 對五味子8 個(gè)木脂素類成分總含量（Y）進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析和方差分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型方程：Y=2 403.40+1.13A+270.25B+385.63C–18.50AB–20.75AC–261.00BC–79.08A2+4.17B2–425.57C2。模型的方差分析結(jié)果見表4。

表4 優(yōu)化五味子提取工藝Box-Behnken響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果

由表4 方差分析結(jié)果可知，模型F值為6.34，P值為0.011 8<0.05，表明該模型顯著。模型相關(guān)系數(shù)（r）=0.890 8，校正決定系數(shù)（R2Adj）=0.750 3，表明此模型可以解釋75.03%的響應(yīng)值變化，誤差較小。各項(xiàng)方差分析中，B對8個(gè)木脂素類成分總含量的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），C2、C對8個(gè)木脂素類成分總含量的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明這些因素的改變會對結(jié)果響應(yīng)產(chǎn)生顯著影響。通過比較A、B、C三因素的F值可知，各因素對8個(gè)木脂素類成分總含量的影響程度為C>B>A。綜上所述，該模型結(jié)果可靠性強(qiáng)、擬合度較好，可用來對超聲輔助提取五味子中8個(gè)木脂素類成分工藝研究進(jìn)行初步分析和預(yù)測。

2.3.3 響應(yīng)面圖與等高線圖分析 為更直觀地分析提取條件中各變量之間的交互作用，利用Design Expert 11軟件選取2個(gè)因素繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖（圖1）。由圖1可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，8個(gè)木脂素類成分總含量逐漸增加，隨著料液比和超聲時(shí)間的增加，總含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，料液比的響應(yīng)曲面最為陡峭，對響應(yīng)值的影響最為顯著，超聲時(shí)間的影響最小，甲醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的交互作用、超聲時(shí)間和料液比的交互作用對總含量影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，超聲時(shí)間和甲醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.4 最優(yōu)提取工藝確定與驗(yàn)證 利用Design Expert 11 軟件進(jìn)行計(jì)算，得到五味子藥材中8 個(gè)木脂素類成分最佳提取工藝的理論預(yù)測條件：超聲時(shí)間為28.72 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%，料液比為1.00∶52.99，預(yù)測得到的8 個(gè)木脂素類成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 670.15～2 688.15μg·g–1。結(jié)合實(shí)際操作的可行性，將提取工藝條件修正為超聲時(shí)間30 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%，料液比1∶50，按照確定的最佳提取工藝平行制備3 份，得到實(shí)際8 個(gè)木脂素類成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2 687.35、2 680.58、2 678.56μg·g–1，表明多元回歸方程具有良好的預(yù)測性。

2.4 樣品溶液制備

將樣品粉碎，取粉末約1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇50 mL，超聲提取30 min后取出，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5 五味子中8個(gè)木脂素類成分的含量測定

2.5.1 專屬性考察 精密吸取空白溶劑（甲醇）、混合對照品溶液、供試品溶液各10μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜圖見圖2。供試品溶液色譜圖中的色譜峰與對照品溶液色譜圖中的色譜峰一一對應(yīng)，空白溶劑色譜圖中沒有相應(yīng)保留時(shí)間的色譜峰，表明該方法的專屬性良好。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，置10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得一系列不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。見表5。

表5 五味子8個(gè)木脂素類成分的線性關(guān)系

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行日內(nèi)精密度考察；連續(xù)進(jìn)樣3 d，進(jìn)行日間精密度考察。檢測各成分所對應(yīng)的色譜峰峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度試驗(yàn)五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的色譜峰峰面積RSD分別為0.15%、0.14%、0.18%、0.18%、0.15%、0.14%、0.17%、0.17%；日間精密度試驗(yàn)的RSD 分別為1.02%、1.00%、1.05%、0.83%、0.81%、0.87%、0.46%、0.57%，均小于2%，表明方法精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批的五味子藥材（S11），按2.4 項(xiàng)下方法平行制備6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算8 個(gè)木脂素類成分含量的RSD，結(jié)果分別為1.21%、1.11%、1.17%、1.26%、1.21%、1.16%、1.55%、1.07%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批五味子藥材（S11）9 份，每份約0.5 g，分別加入50%、100%、150%的混合對照品溶液適量，按2.4項(xiàng)下方法制備，每個(gè)濃度平行3 份，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見表6。

表6 五味子8個(gè)木脂素類成分加樣回收率試驗(yàn)

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批的五味子藥材（S11），按2.4項(xiàng)下方法制備，分別于制備后0、2、4、8、12、24、48 h后按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算五味子醇甲、五味子醇乙、當(dāng)歸酰戈米辛H、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的峰面積RSD，結(jié)果分別為1.21%、1.08%、1.12%、1.18%、1.12%、0.88%、1.00%、2.14%，表明供試品在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 含量測定 按2.4 項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按2.1 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各指標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表7。

表7 15批五味子藥材中8個(gè)木脂素類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討論

實(shí)驗(yàn)中采用全波長掃描（210～380 nm）測定對照品溶液，結(jié)果表明，檢測波長為220 nm 時(shí)各對照品響應(yīng)均很高，因此選擇220 nm 作為最終檢測波長；有機(jī)相考察了甲醇和乙腈，對比發(fā)現(xiàn)，用乙腈-水體系時(shí)基線比較平穩(wěn)，但色譜峰峰形不是特別好，特別是當(dāng)歸酰戈米辛H 拖尾比較嚴(yán)重，為了改善峰形，減少拖尾現(xiàn)象，在水相中加入體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、0.2%、0.5%的磷酸，考察其對色譜參數(shù)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水相中磷酸體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)色譜基線較好，指標(biāo)成分的對稱因子接近1，拖尾現(xiàn)

象明顯改善、分離度較高、理論板數(shù)較高，因此選擇磷酸的體積分?jǐn)?shù)為0.5%；對于色譜柱，首先嘗試了通用型色譜柱Agilent ZORBAX?Eclipse plus，該色譜柱幾乎適用于所有類型的樣品，包括酸性、堿性和中性化合物。結(jié)果顯示，大部分化合物均達(dá)到較好的分離效果，但是極性小的化合物分離不開。之后又考察了Waters XSelect?HSS T3 和Agilent ZORBAX EXTEND-C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)在XSelect?HSS T3色譜柱條件下化合物前延比較嚴(yán)重，改善流動(dòng)相后也沒有較好的改善，而Agilent ZORBAX EXTEND-C18相比而言，峰形和分離度都較好，出峰時(shí)間也比較適宜。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取五味子藥材中8個(gè)木脂素類成分，通過Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，得到超聲時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比對五味子中8 個(gè)木脂素類成分總含量的回歸模型，進(jìn)而分析得出最佳提取工藝為超聲時(shí)間30 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為100%，料液比1∶50。三者的影響主次關(guān)系為料液比>甲醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間。通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明實(shí)測值與預(yù)測值的相對誤差在合理范圍內(nèi)，說明該優(yōu)化工藝較為科學(xué)、可靠、準(zhǔn)確，可用于五味子藥材中木脂素類成分的提取。在此基礎(chǔ)上，本研究建立了同時(shí)測定五味子藥材中8 個(gè)木脂素類成分含量的HPLC，此方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、簡單高效，可為五味子藥材的質(zhì)量控制提供參考。15批不同產(chǎn)地的五味子藥材中8 個(gè)木脂素類成分的含量的RSD 為8.09%～19.29%，表明各產(chǎn)地藥材質(zhì)量有一定差異，可能與當(dāng)?shù)氐牡刭|(zhì)、水源及氣候條件有關(guān)，更明確的原因需要做進(jìn)一步的分析研究。