姚亞亞， 王瀅穎， 周晨霞， 劉 爽， 郭愛(ài)良， 李慧靜

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院1，保定 071001)(北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心；北京工商大學(xué)2，北京 100048)

小麥蛋白含量是評(píng)價(jià)小麥粉品質(zhì)的重要指標(biāo)，然而，在過(guò)敏原易感人群中，特定的小麥蛋白會(huì)引發(fā)不良的免疫反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，如小麥過(guò)敏、貝克哮喘和小麥依賴(lài)性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)(WDEIA)。目前，國(guó)家提倡小麥全產(chǎn)業(yè)鏈，從種植、收獲到生產(chǎn)加工一體化全過(guò)程，小麥品質(zhì)保障、安全生產(chǎn)應(yīng)從源頭抓起。

小麥籽粒蛋白質(zhì)的含量和組成是由遺傳和環(huán)境因素共同決定的[1, 2]。Monaghan等[3]指出在相同條件下，烘焙面包的小麥基因型比其他小麥基因型產(chǎn)生的小麥籽粒蛋白質(zhì)的含量高出2%。然而，與遺傳因素相比，Kindred等[4]指出氮的有效性或同化吸收速率對(duì)小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的影響(高達(dá)2倍)較大。提高全氮量是改善小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的有效措施。然而，由于氮利用效率降低、環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)增加等非預(yù)期的副作用，以及高氮應(yīng)用帶來(lái)的其他生態(tài)問(wèn)題[5]，應(yīng)探索栽培條件來(lái)減少這些問(wèn)題。為了在不增加施氮量的情況下保持對(duì)小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的滿(mǎn)意，集約化小麥生產(chǎn)中普遍推薦采用施氮分施和改施時(shí)機(jī)。

蛋白質(zhì)組成作為影響加工功能、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和免疫原性潛能的重要品質(zhì)性狀，也受到施氮的有效調(diào)控[6]。氮肥是影響小麥籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)的重要管理因素之一[7, 8]。吳培金等[9]研究表明增施氮肥可提高小麥籽粒蛋白質(zhì)及其組分含量。施氮時(shí)間對(duì)小麥籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)也有顯著影響。據(jù)報(bào)道，通過(guò)選擇與生育發(fā)育相適應(yīng)的氮素施用時(shí)間可以提高蛋白質(zhì)在谷物中的合成和儲(chǔ)存量，適當(dāng)推遲施氮肥時(shí)間會(huì)增加面筋蛋白的含量[10]，施氮時(shí)間過(guò)遲，可能會(huì)限制氮轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的數(shù)量[11]。楊麗娟等[11]研究了起身期、拔節(jié)期、孕穗期和開(kāi)花期4個(gè)時(shí)期追施氮肥對(duì)新麥26籽粒產(chǎn)量及小麥粉品質(zhì)的影響，其結(jié)果表明在孕穗開(kāi)始時(shí)追施氮肥較好。Rossmann等[12]研究表明可通過(guò)后期施氮肥改變小麥粉蛋白組分組成使小麥粉具有良好的烘焙品質(zhì)。此外，Rossmann等[13]還研究表明花期葉面施氮是提高蛋白質(zhì)濃度和蛋白質(zhì)組成的常用方法?？偟膩?lái)講，通過(guò)改變施氮時(shí)間可獲得較好品質(zhì)小麥粉。

由此可見(jiàn)，人們通過(guò)改變施氮時(shí)機(jī)和氮肥分施等措施提高蛋白質(zhì)的含量，從而提高小麥粉品質(zhì)。然而，小麥粉蛋白作為一種潛在的過(guò)敏原，對(duì)小麥粉過(guò)敏患者產(chǎn)生巨大的影響。目前，據(jù)研究表明，α-淀粉酶、非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白和胰蛋白酶抑制劑可引起面包師哮喘[14]，ω5-醇溶蛋白、高分子質(zhì)量麥谷蛋白和γ-醇溶蛋白可引起小麥依賴(lài)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)型(WDEIA)癥狀[15]，小麥中α/β-醇溶蛋白可導(dǎo)致小麥過(guò)敏患者乳糜瀉癥狀的發(fā)生，此外低分子質(zhì)量麥谷蛋白是作為獨(dú)立的過(guò)敏原可促進(jìn)局部炎癥的發(fā)生[16]。所以，一方面需要保證小麥籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)，另一方面需要保證小麥粉有較弱的致敏性。Zhong等[17]研究對(duì)不同施氮時(shí)間調(diào)控的差異表達(dá)蛋白(DEPs)進(jìn)行鑒定，并在差異性表達(dá)蛋白中檢測(cè)了其中的過(guò)敏原相關(guān)蛋白，其結(jié)果表明，延遲施氮可降低致敏性相關(guān)蛋白的含量。到目前為止，施氮時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)組分的影響信息較少，對(duì)蛋白致敏性的影響較少涉及。

本研究在田間栽培了3個(gè)高筋含量小麥品種，根據(jù)葉齡不同和施氮肥時(shí)間不同，將成熟的小麥籽粒用LRMM-8040-3-D實(shí)驗(yàn)?zāi)シ蹤C(jī)磨成粉。評(píng)價(jià)不同葉齡期施氮肥對(duì)小麥總蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)組分的影響。此外，通過(guò)免疫印跡技術(shù)對(duì)小麥粉蛋白組分致敏性進(jìn)行分析。本研究目標(biāo)是揭示施氮肥時(shí)間對(duì)小麥粉蛋白組分及其致敏性的影響。研究結(jié)果可為通過(guò)不同施氮時(shí)間處理提高小麥粉安全性提供新的思路。另外，小麥過(guò)敏癥不易治愈[18]，所以選擇低敏小麥品種或者降低小麥過(guò)敏原的致敏性，對(duì)于患有過(guò)敏癥或者尚不知曉自身患病的消費(fèi)者是一種保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小麥品種：石4366(SH4366)、科農(nóng)2009(KN2009)、藁優(yōu)2018(GY2018)。所用小麥品種原材料由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，其大田種植實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為選用3個(gè)品種，樣品種植采用二因素裂區(qū)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主區(qū)為3個(gè)，每個(gè)品種都設(shè)有副區(qū)為追氮時(shí)期，設(shè)春3葉露尖(N3)、春4葉露尖(N4)、春5葉露尖(N5)和春6葉露尖(N6)追氮4個(gè)水平。種植小區(qū)面積44 m2，3次重復(fù)，共36個(gè)小區(qū)。春季灌2次水，N3、N4、N5和N6分別在相應(yīng)追氮時(shí)期灌第1次水并追施氮肥(施底肥后旋耕2遍，15 cm等行距播種，總施肥量為純氮240 kg/hm2、磷(P2O5)為135kg/hm2、鉀(K2O)為150 kg/hm2，其中磷肥和鉀肥及50%的氮肥作底肥，其余50%氮肥按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的春生葉齡期追施)，開(kāi)花期灌第2次水。將收獲后的小麥用LRMM-8040-3-D實(shí)驗(yàn)?zāi)シ蹤C(jī)磨成粉，取小麥粉作為本研究的實(shí)驗(yàn)材料。12例小麥過(guò)敏患者血清由中國(guó)解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院和北京軍區(qū)總醫(yī)院提供，過(guò)敏患者血清的sIgE水平已被發(fā)表[19]，3例小麥正常者血清由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院提供。

1.1.2 試劑

檸檬酸、磷酸三鈉、考馬斯亮藍(lán)(G-250)、丙烯酰胺(Acr)、甲叉丙烯酰胺(Bis)、過(guò)硫酸銨(AP)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(lán)(R-250)；牛血清白蛋白(BSA)；標(biāo)準(zhǔn)蛋白；小麥過(guò)敏原ELISA檢測(cè)試劑盒；聚偏氟乙烯(PVDF)膜；34079型ECL試劑盒；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗人IgE；其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ZNCL-S140X140磁力攪拌器，PHS-3C型pH計(jì)，DYCZ-28A型單板夾芯式垂直電泳儀，電熱恒溫培養(yǎng)箱，Multiskan FC型酶標(biāo)儀，LRMM-8040-3-D實(shí)驗(yàn)?zāi)シ蹤C(jī)，DYCZ-40B電轉(zhuǎn)儀。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

根據(jù)GB 5009.5—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，采用微量凱氏定氮法測(cè)定不同葉齡期追施氮肥及不同品種小麥粉蛋白質(zhì)的含量。

1.2.2 小麥粉過(guò)敏原粗提取

稱(chēng)取0.2 g小麥粉，分別以1∶20的質(zhì)量體積比加入30 mmoL/L，檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)，恒溫22 ℃下攪拌4 h。3 000×g離心20 min，收集上清，提取物在-20 ℃下儲(chǔ)存，以備后用。采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)測(cè)定不同品種小麥粉蛋白質(zhì)的含量，使用牛血清白蛋白配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，量取一定體積的樣品處理液，用酶標(biāo)儀測(cè)量其吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)定為595 nm，使其測(cè)定結(jié)果保持在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)范圍內(nèi)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)找出與其等值的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度，從而計(jì)算出樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)，進(jìn)而得出樣品蛋白質(zhì)的含量。

1.2.3 過(guò)敏原含量的測(cè)定

采用商用試劑盒生物素雙抗體夾芯式酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定小麥粉過(guò)敏原含量，從冷藏室取出試劑盒，平衡至室溫。根據(jù)說(shuō)明首先稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，然后設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本反應(yīng)孔，空白孔中不加樣品、鼠抗小麥過(guò)敏原(OVA)單克隆抗體、鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，其各步驟操作相同；標(biāo)準(zhǔn)品孔根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)依次加入試劑，標(biāo)準(zhǔn)品和鏈霉親和素-HRP各50 μL，樣本反應(yīng)孔加入已經(jīng)處理的樣本40 μL，然后各加入OVA抗體10 μL，鏈霉親和素-HRP 50 μL。蓋上封板膜，輕輕混勻，放置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃溫育60 min。溫育結(jié)束，取出樣品板小心揭掉封板膜，棄去液體，拍干。向各孔中加入洗滌液250 μL，靜置30 s后棄去，拍干，上述洗滌過(guò)程重復(fù)5次。洗滌后每孔先加入50 μL顯色劑A，后加入50 uL顯色劑B，振蕩混勻，置于恒溫箱中37 ℃進(jìn)行10 min的避光顯色。每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)，樣品顏色立刻由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色，此時(shí)用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度值(顯色及測(cè)量過(guò)程不超過(guò)10 min，故終止液添加要迅速)。

1.2.4 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)垂直電泳，采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，使用微型加樣針進(jìn)樣，將處理好的樣品沸水浴加熱5 min，樣品上樣量為10 μg。用導(dǎo)線(xiàn)將電泳模具與電泳儀鏈接，啟動(dòng)電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)至160 V，待染料前沿遷移至橡膠框底邊1 cm處，停止電泳并記錄好時(shí)間。取下凝膠，將凝膠置于固定液(含50%乙醇和10%冰乙酸的水溶液)中固定2 h，傾去固定液，置于考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色液(用固定液配制體積分?jǐn)?shù)為0.25%的染色液)染色2～5 h，傾去染色液，加入脫色液(含20%乙醇和7%冰乙酸的水溶液)，幾小時(shí)更換1次脫色液，直到凝膠的藍(lán)色背景完全褪去，蛋白質(zhì)的電泳條帶清晰為止。

1.2.5 免疫印跡

采用免疫印跡技術(shù)對(duì)小麥粉蛋白組分進(jìn)行免疫學(xué)特性分析。首先采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)垂直電泳，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，進(jìn)行電泳，電泳后再將膠放入電轉(zhuǎn)液浸泡30 min，電轉(zhuǎn)時(shí)，按照墊片、濾紙、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、膠、濾紙、墊片的順序組裝在一起，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；將PVDF膜放置于3%BSA中封閉60 min；之后進(jìn)行洗膜，用1×TBST溶液洗滌5次，每次3 min；用3%BSA將血清按照1∶400的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)尤胙澹?7 ℃孵育2 h；同上洗膜，用1×TBST溶液洗滌5次，每次3 min；再加入用3%BSA將血清按照1∶5 000的比例進(jìn)行稀釋的二抗，置于搖床上37 ℃孵育1 h，同上洗膜5次后將ECL試劑盒中A液和B液按照1∶1比例混合取1 mL置于PVDF膜上；顯影、定影后攝像分析相對(duì)分子質(zhì)量。以3例正常人的血清和血清池為陰性對(duì)照，采用免疫印跡技術(shù)進(jìn)行免疫學(xué)特性分析鑒定小麥粉中存在的小麥非過(guò)敏原，操作步驟同上所述。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncan進(jìn)行多重比較(P<0.05)，采用Quantity One 4.6.2對(duì)電泳圖譜和免疫印跡圖進(jìn)行分析，采用Origin 2021軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉齡期追施氮肥對(duì)小麥粉蛋白質(zhì)含量的影響

小麥中含有8%～15%的蛋白質(zhì)，主要是由清蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、醇溶蛋白(gliadin)和麥谷蛋白(glutenin)組成，其中麥醇溶蛋白和麥谷蛋白為面筋蛋白，也合稱(chēng)儲(chǔ)藏蛋白，占小麥蛋白干基的80%[20]。蛋白質(zhì)含量與組分是小麥籽粒品質(zhì)形成機(jī)制的重要組成部分，其主要包含前期小麥開(kāi)花前氮素和花后氮素的同化和吸收，形成蛋白質(zhì)底物，進(jìn)而利用蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵酶合成蛋白質(zhì)[21]。小麥粉中蛋白質(zhì)的含量可反映不同施氮時(shí)期小麥的氮吸收和轉(zhuǎn)化效果。由表1分析可知，從不同葉齡期追施氮肥期對(duì)小麥粉中蛋白質(zhì)含量來(lái)看，KN2009小麥在春3葉露尖(N3)、春4葉露尖(N4)、春5葉露尖(N5)和春6葉露尖(N6)等不同時(shí)期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中蛋白質(zhì)含量先增加后減少，當(dāng)處于N4期追施氮肥，小麥粉中蛋白質(zhì)含量最高。SH4366小麥品種在N3、N4、N5和N6等不同時(shí)期追氮，小麥粉中蛋白質(zhì)含量先減少后增加，N3、N4和N6期蛋白質(zhì)的含量均高于N5期。GY2018小麥品種在在N3、N4、N5和N6等不同時(shí)期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中蛋白質(zhì)含量先增加后減少再增加，N4和N6時(shí)期小麥粉中蛋白質(zhì)含量均高于N3和N5時(shí)期小麥粉中蛋白質(zhì)含量。由此可見(jiàn)，隨著施氮時(shí)間的改變，不同品種中小麥粉中蛋白質(zhì)含量變化不穩(wěn)定。因此只考慮蛋白質(zhì)含量指標(biāo)無(wú)法對(duì)施氮期小麥品質(zhì)和安全性做出準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)，故進(jìn)一步對(duì)其總過(guò)敏原含量及其蛋白組分進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析。

表1 不同葉齡期追施氮肥小麥粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

2.2 過(guò)敏原含量測(cè)定結(jié)果

小麥粉過(guò)敏原含量是對(duì)易感小麥過(guò)敏人群安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。在種植過(guò)程中，除了考慮小麥籽粒的加工品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)外，小麥安全性也應(yīng)該被考慮在內(nèi)。由圖1可知，KN2009小麥品種在春3葉露尖(N3)、春4葉露尖(N4)、春5葉露尖(N5)和春6葉露尖(N6)等不同時(shí)期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中過(guò)敏原的含量增加，當(dāng)處于N4期追施氮肥，小麥過(guò)敏原的含量最低，相較于N3、N5和N6時(shí)期，小麥過(guò)敏原含量分別降低了2.75%、13.11%和9.40%，N3和N4期變化不顯著。SH4366小麥品種在N3、N4、N5和N6等不同時(shí)期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中過(guò)敏原的含量逐漸減少，當(dāng)處于N6期追施氮肥，小麥過(guò)敏原含量最低，相較于N3、N4和N5時(shí)期，小麥過(guò)敏原含量分別降低了28.68%、12.38%和18.58%。GY2018小麥品種在N3、N4、N5和N6等不同時(shí)期追氮，隨著春葉露尖期追施氮肥期的延遲，小麥粉中過(guò)敏原的含量先減少后增加，當(dāng)處于N4期追施氮肥，小麥過(guò)敏原含量最低，相較于N3、N5和N6時(shí)期，小麥過(guò)敏原含量分別降低了22.22%、2.00%和15.52%。Zhong等[17]通過(guò)參照葉齡調(diào)整追施氮肥的時(shí)機(jī)，發(fā)現(xiàn)延緩施氮處理可降低過(guò)敏蛋白含量。

從小麥粉過(guò)敏原含量的變化趨勢(shì)中，僅得出不同葉齡期追施氮肥對(duì)不同小麥品種在各個(gè)時(shí)期過(guò)敏原含量多少，而無(wú)法得出施氮時(shí)間的改變對(duì)小麥蛋白質(zhì)的某種具體組分存在影響，從而導(dǎo)致小麥粉過(guò)敏性的變化。因此，進(jìn)一步分析不同葉齡期追施氮肥對(duì)小麥粉蛋白質(zhì)組分以及其致敏性的影響。

注：同一品種標(biāo)有不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。圖1 不同葉齡期追施氮肥對(duì)小麥粉過(guò)敏原含量的影響

2.3 小麥粉蛋白SDS-PAGE分析

注：M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1、2、3、4泳道分別為KN2009小麥品種的N3、N4、N5、N6施氮時(shí)期；5、6、7、8泳道分別為SH4366小麥品種的N3、N4、N5、N6施氮時(shí)期；9、10、11、12泳道分別為GY2018小麥品種的N3、N4、N5、N6施氮時(shí)期，下同。圖2 不同葉齡期施氮處理的小麥粉蛋白SDS-PAGE圖

采用SDS-PAGE方法分析了不同施氮時(shí)間對(duì)小麥粉蛋白質(zhì)亞基的影響。圖2顯示了追施氮肥對(duì)不同品種小麥粉蛋白質(zhì)亞基的影響結(jié)果，結(jié)果表明各品種小麥粉蛋白亞基組成未改變。蛋白質(zhì)亞基條帶的顏色深度改變表示蛋白質(zhì)亞基含量變化，使用Quantity One軟件分析SDS-PAGE電泳圖譜各泳道和條帶的灰度值，分析結(jié)果如圖3所示。如圖3a所示，隨著施氮時(shí)間的延遲，KN2009和SH4366小麥粉蛋白組分整體灰度均有所降低，GY2018小麥粉蛋白組分整體灰度逐漸增加。如圖3b所示，KN2009的小麥粉高分子質(zhì)量麥谷蛋白(HMW-GS)的含量隨施氮時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加；ω-麥醇溶蛋白含量的變化類(lèi)似于高分子質(zhì)量麥谷蛋白的變化，但其變化不明顯；低分子質(zhì)量麥谷蛋白(LMW-GS)和α-和γ-麥醇溶蛋白的含量隨施氮時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減少；在N4，N5和N6期間，清蛋白和球蛋白的含量降低，差異不明顯。如圖3c所示，SH4366小麥粉HMW-GS含量隨施氮時(shí)間的延長(zhǎng)先降低后增加；ω-麥醇溶蛋白含量的變化不明顯；LMW-GS和α-和γ-麥醇溶蛋白的含量增加，而清蛋白和球蛋白的含量逐漸減少。如圖3d所示，GY2018小麥粉HMW-GS的含量隨施氮時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減少；ω-麥醇溶蛋白的含量先降低后增加；此外，LMW-GS和γ-麥醇溶蛋白的趨勢(shì)與清蛋白和球蛋白相反，LMW-GS和α-和γ-麥醇溶蛋白逐漸增加，清蛋白和球蛋白逐漸減少，這表明施氮時(shí)間對(duì)氮肥的吸收利用效率有一定的調(diào)節(jié)作用。

注：1、2、3、4分別為HMW-麥谷蛋白、ω-醇溶蛋白、LMW-麥谷蛋白與α- 和γ-醇溶蛋白、清蛋白和球蛋白。圖3 小麥粉蛋白SDS-PAGE圖灰度值分析

因此，本研究表明不同施氮時(shí)間處理對(duì)小麥粉蛋白質(zhì)亞基組成未改變，但對(duì)小麥粉蛋白質(zhì)亞基含量造成改變，針對(duì)不同品種小麥粉蛋白質(zhì)亞基變化不一，不同施氮時(shí)間對(duì)小麥不同品種的蛋白質(zhì)組分調(diào)節(jié)效應(yīng)不同，這與張寶軍等[22]報(bào)道的一致，蛋白質(zhì)組分中清蛋白和谷蛋白隨施肥時(shí)期推后，呈遞增趨勢(shì)，但球蛋白以拔節(jié)期施肥含量最高，醇溶蛋白以拔節(jié)期或返青期施肥含量最高。石書(shū)兵等[23]在研究了不同施氮期對(duì)新疆冬小麥蛋白組分的影響，結(jié)果表明隨施氮時(shí)期延遲，小麥中的清蛋白和球蛋白含量減少，麥谷蛋白和麥醇溶蛋白的含量有所增加。劉尊英[24]研究表明推遲施氮時(shí)間，清蛋白含量變化不明顯，醇溶蛋白的含量在抽穗期追施氮肥時(shí)為最高，球蛋白和麥谷蛋白的含量在孕穗期追施氮肥含量最高。李?yuàn)檴櫟萚25]得出了類(lèi)似的結(jié)論，研究表明清蛋白與追氮時(shí)期的關(guān)系不大?？傊P(guān)于施氮時(shí)期和籽粒中蛋白質(zhì)亞基含量的關(guān)系問(wèn)題，前人研究結(jié)果均存在一定差異，這可能是由于選用的小麥品種不同而造成的。因此，關(guān)于研究不同春生葉齡期施氮對(duì)小麥粉蛋白致敏性的影響，還需對(duì)不同施氮時(shí)間處理的不同小麥品種的小麥粉蛋白組分免疫表達(dá)還需進(jìn)一步分析。

2.4 小麥粉蛋白免疫印跡

小麥粉作為人類(lèi)飲食的重要組成部分，有引發(fā)食物過(guò)敏的缺點(diǎn)，影響6%～8%的兒童和1%～3%的成人[26]。本研究以12例小麥粉過(guò)敏患者混合血清為一抗，3例非小麥粉過(guò)敏患者混合血清為陰性對(duì)照(圖4)，采用免疫印跡技術(shù)分析不同葉齡期追施氮肥對(duì)小麥粉蛋白致敏性的影響(圖5)。采用Quantity One軟件分析免疫印跡圖各泳道和條帶的光強(qiáng)度，用光強(qiáng)度表示小麥粉和組分致敏性的變化(圖6)。

圖4 不同葉齡期施氮處理的小麥粉與小麥非過(guò)敏患者血清反應(yīng)的免疫印跡圖

圖5 不同葉齡期施氮處理的小麥粉與小麥過(guò)敏患者血清反應(yīng)的免疫印跡圖

圖6 小麥粉免疫印跡光強(qiáng)度值分析

圖4表明亞基分子質(zhì)量在48 ku的蛋白為非致敏性蛋白，此外，非過(guò)敏患者免疫印跡圖中各泳道上端部分殘留有較深印跡，該部分為非致敏性蛋白，因此在分析小麥粉與過(guò)敏患者血清免疫印跡圖時(shí)，將此部分排除。如圖6所示，隨著施氮時(shí)間的延遲，3種小麥品種的小麥過(guò)敏原亞基致敏性發(fā)生了變化。KN2009小麥粉HMW-GS的致敏性先增高后降低，LMW-GS、α-和γ-麥醇溶蛋白，清蛋白和球蛋白的致敏性增加，ω-麥醇溶蛋白的致敏性變化不明顯，排除分子質(zhì)量在48 ku的蛋白，N3時(shí)期小麥粉各組分蛋白致敏性最低。SH4366小麥粉中，除了清蛋白和球蛋白致敏性增加之外，其余的致敏性先增加后減少，總的來(lái)看，N3時(shí)期施氮肥安全性較高。GY2018小麥粉致敏性的變化主要取決于高分子質(zhì)量麥谷蛋白和ω-麥醇溶蛋白的變化，高分子質(zhì)量麥谷蛋白的致敏性先降低后增高，ω-麥醇溶蛋白的致敏性逐漸降低，其他過(guò)敏原含量無(wú)明顯變化。因此從其各組分與過(guò)敏患者血清結(jié)合強(qiáng)度綜合分析，建議KN2009和SH4366小麥品種在N3時(shí)期施氮肥，GY2018小麥品種在N5時(shí)期施氮肥較適宜。

由圖5可知，3種小麥品種均表明施氮時(shí)間對(duì)小麥粉蛋白致敏性存在顯著影響，但不同小麥品種含有的小麥粉蛋白所表現(xiàn)出的致敏性不一致，這是由于小麥品種本身決定的，不同小麥籽粒中蛋白質(zhì)組分含量存在較大差異[14, 27, 28]。Pak等[29]通過(guò)比較8種不同種類(lèi)小麥品種，結(jié)果表明不同品種小麥各蛋白組分致敏性不同且有顯著差異。Nakamura等[30]比較了321個(gè)小麥品種的致敏性，并篩選出相對(duì)較低致敏性的小麥品種。就所研究的3個(gè)小麥品種而言，不同小麥品種的主要致敏蛋白亞基是不同的。Tea等[31]研究表明，葉面施肥提供的氮主要存在于貯藏蛋白中。從研究的3種小麥品種來(lái)看，不同品種小麥所含主要的致敏蛋白組分不一樣。高分子質(zhì)量麥谷蛋白和ω-麥醇溶蛋白均是3種小麥品種的主要致敏蛋白，KN2009、 SH4366 和GY2018均含有分子質(zhì)量為29 ku的較強(qiáng)致敏性亞基蛋白，KN2009比SH4366 、GY2018小麥品種多了一種分子質(zhì)量為26 ku的較強(qiáng)致敏性亞基蛋白。此外，KN2009與SH4366、GY2018均含有分子質(zhì)量為43 ku的致敏性亞基蛋白，而GY2018含有與其相異的分子質(zhì)量為38 ku的致敏性亞基蛋白。

Kohno等[32]評(píng)估了低過(guò)敏性的面包小麥缺乏編碼ω-麥醇溶蛋白的基因。Zhong等[17]研究在小麥植株在上五葉(TL5)、上三葉(TL3)和上一葉(TL1)出現(xiàn)時(shí)，對(duì)不同施氮時(shí)間調(diào)控的差異表達(dá)蛋白(DEPs)進(jìn)行鑒定，在差異性表達(dá)蛋白中檢測(cè)了其中的過(guò)敏原相關(guān)蛋白，包括α-嘌呤硫素、二聚α-淀粉酶抑制劑0.19、奇異果甜蛋白和單體α-淀粉酶抑制劑，且α-嘌呤硫素在TL1時(shí)期的含量高于TL3時(shí)期，其結(jié)果表明，延遲施氮可降低致敏性相關(guān)蛋白的含量。

3 結(jié)論

通過(guò)分析不同葉齡期施氮對(duì)小麥粉蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)組分以及致敏性的影響，結(jié)果表明，施氮時(shí)間不僅對(duì)小麥粉蛋白質(zhì)含量有顯著影響，對(duì)其蛋白質(zhì)亞基含量及其免疫性表達(dá)也存在顯著性影響。不同小麥品種的小麥粉蛋白免疫性表達(dá)不同，這是由于小麥品種自身遺傳基因決定的。不同葉齡期施氮對(duì)小麥粉蛋白致敏性的影響表明，KN2009與SH4366小麥隨施氮時(shí)間的推遲，小麥粉蛋白的致敏性增強(qiáng)，GY2018小麥品種隨施氮肥時(shí)間的延遲，致敏蛋白含量逐漸降低，因此KN2009和SH4366小麥品種在N3時(shí)期施氮肥，GY2018小麥品種在N5時(shí)期施氮肥較適宜。26、29、38、43 ku的蛋白亞基是KN2009小麥的主要致敏蛋白，29、43 ku的蛋白亞基是SH4366小麥的主要致敏蛋白，29、38、43 ku的蛋白亞基是GY2018小麥的主要致敏蛋白。此外，施氮時(shí)間的延遲，主要影響的小麥粉的致敏蛋白包括高分子質(zhì)量麥谷蛋白，ω-麥醇溶蛋白以及分子質(zhì)量在26、29、38、43 ku的蛋白亞基?？梢酝ㄟ^(guò)合理的改變施氮時(shí)間來(lái)降低小麥粉中致敏蛋白的含量。根據(jù)分析出的主要致敏蛋白，可通過(guò)改變小麥蛋白基因型或在不改變小麥品質(zhì)的情況下去除致敏蛋白。因此本研究有助于為后期通過(guò)改變?cè)耘鄺l件等減少這些蛋白質(zhì)的潛在有害影響，以獲得安全性較高的小麥粉加工原料。