馬騰飛

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

蒎烯（C10H16）是一種重要的天然單萜化合物，在自然界中主要以α-蒎烯和β-蒎烯的兩種異構(gòu)體形式存在，其異構(gòu)體如下：

蒎烯主要存在于自然界的松柏杉植物中，松柏杉植物的分泌物可用于提取松節(jié)油，松節(jié)油的主要成分—蒎烯含量高達(dá)90%。目前，工業(yè)上提取蒎烯的主要方法是從針葉植物中提取松節(jié)油，再?gòu)乃晒?jié)油中通過一些蒸餾、減壓精餾等方法提取蒎烯。雖然我國(guó)的松柏杉屬植物資源種類繁多且分布較廣，但是通過化工手段提取蒎烯成本昂貴、工藝復(fù)雜、浪費(fèi)資源而且對(duì)環(huán)境有較大污染。隨著微生物工程和代謝工程的發(fā)展，通過生物合成手段生產(chǎn)蒎烯有望在將來(lái)成為替代化工合成的策略。蒎烯可由前體物質(zhì)牻牛兒基焦磷酸（geranyl pyrophosphate，GPP）通過蒎烯合酶作用生成。在蒎烯化合物的合成過程中，由于合成蒎烯所需的萜類合酶（terpene synthases，TPS）催化合成的多樣性[1-2]，使得最終生成的萜類化合物種類豐富、結(jié)構(gòu)繁多，具有不同的理化性質(zhì)和生物活性，在能源、醫(yī)藥、軍事、食品、日化用品等多個(gè)領(lǐng)域擁有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景，所以通過微生物合成蒎烯具有重要意義。

1 蒎烯的用途

蒎烯由于獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)在能源、醫(yī)藥、化工、食品、和材料等領(lǐng)域發(fā)揮著巨大作用，具有重大的利用價(jià)值和發(fā)展空間。

1.1 能源方面

人類的一切經(jīng)濟(jì)活動(dòng)和生存都依賴于能源的供給，而開采其他資源和利用其他資源也都要依賴能源，能源需求問題影響著人類的生存和發(fā)展，能源的消耗量已成為衡量人民生活水平的標(biāo)準(zhǔn)，隨著人口的不斷增長(zhǎng)和人類現(xiàn)有能源的日趨減少，尋求新型、高能和可持續(xù)生產(chǎn)的能源迫在眉睫。蒎烯由于其獨(dú)特的雙鍵和雙環(huán)結(jié)構(gòu)可以在特定條件下通過環(huán)化加氫形成蒎烯二聚體。其二聚體具有與高能燃料JP-10相似的高體積能量[3-5]，被認(rèn)為是噴氣式飛機(jī)及火箭燃料的替代品，因此具有極高的商業(yè)和軍事應(yīng)用價(jià)值。

1.2 醫(yī)藥方面

近年來(lái)人們對(duì)蒎烯的關(guān)注增加，對(duì)α-蒎烯的藥理研究也不斷增多，并且越來(lái)越多的被應(yīng)用到醫(yī)藥領(lǐng)域，如小兒感冒顆粒[6]、桉檸蒎腸溶軟膠囊[7]等。研究發(fā)現(xiàn)，蒎烯具有抗菌[8]、抗病毒[9]、抗腫瘤[10-11]、抗炎[12]、抗過敏及改善潰瘍等作用[13-14]。雖然蒎烯具有廣泛的藥理性質(zhì)，但藥物活性較低，如何高效發(fā)揮蒎烯的藥物活性還需要對(duì)其進(jìn)行深入研究和改造。

1.3 化工方面

蒎烯除了在能源和醫(yī)藥方面的作用外，還可以用于化工方面。由于松節(jié)油的主要成分蒎烯含量達(dá)90%左右，而我國(guó)又具有豐富的松柏杉資源，故可以利用松節(jié)油提煉蒎烯來(lái)進(jìn)行一系列的化工合成生產(chǎn)產(chǎn)品。如以蒎烯為原料合成熱熔膠和橡膠等材料[15]；蒎烯與冰片烯作用合成的樟腦醌是一種具有光敏和生理活性的單萜類雙酮化合物，應(yīng)用較廣，但是價(jià)格昂貴[16]。而且蒎烯還可以作為很多化工產(chǎn)品的原材料，因此蒎烯在化工方面發(fā)揮著巨大作用。

1.4 食品方面

蒎烯在食品添加劑方面也有著廣泛的用途，目前研究最多的是通過蒎烯來(lái)合成紫蘇糖甜味劑[17]。雖然人們已經(jīng)早已掌握了蔗糖和葡萄糖的提取工藝，但是由于大量攝入蔗糖和葡萄糖容易導(dǎo)致肥胖和糖尿病，從健康方面來(lái)講紫蘇糖是一種優(yōu)質(zhì)的高甜度、低熱量的甜味添加劑，并且紫蘇糖還可以作為糕點(diǎn)、飲料、醬油的防腐劑[18]。

1.5 材料方面

蒎烯在材料方面也有廣泛應(yīng)用。蒎烯樹脂又稱聚萜烯樹脂，是以松節(jié)油為原料通過聚合得到的碳?xì)漕悩渲琜19]。20世紀(jì)初期和末期主要是通過石油為原料合成樹脂材料，但是由于化石能源的不可再生性以及人類對(duì)化石能源的需求量不斷增加，迫使人類尋找環(huán)保型、可再生物質(zhì)來(lái)替代石油。蒎烯樹脂具有很好的工業(yè)加工性，并且原料永不枯竭，低毒環(huán)保，符合可持續(xù)發(fā)展的需求，因此以蒎烯作為原料合成樹脂已經(jīng)逐漸成為一種趨勢(shì)[20]。

2 蒎烯的生物合成途徑

蒎烯屬于萜烯類化合物，萜烯類化合物目前已發(fā)現(xiàn)的種類超8 000種[21]，并且所有的萜烯類化合物都是通過相應(yīng)萜類合酶通過催化對(duì)應(yīng)的前體物質(zhì)進(jìn)行合成。蒎烯的合成通常包括三個(gè)步驟：第一步為五碳模板物質(zhì)異戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）的形成；第二步是以IPP和DMAPP作為前體物質(zhì)合成GPP、法呢基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）、香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）等物質(zhì)；第三步以GPP、FPP、GGPP為前體物質(zhì)通過相應(yīng)的酶催化合成對(duì)應(yīng)的萜類物質(zhì)。蒎烯是由其前體物質(zhì)GPP通過蒎烯合酶（pinene synthase，PS）催化得到。蒎烯合成途徑主要分為甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和甲基赤蘚糖醇-4-磷酸酯（methylerythritol-4-phosphate，MEP）途徑。MVA途徑主要存在于真核生物，部分革蘭氏陰性菌和古細(xì)胞生物中，MVA途徑不僅是蒎烯合成的代謝途徑，而且在細(xì)胞代謝活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用，MVA途徑中關(guān)鍵酶的缺失會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22]。MEP途徑主要存在于細(xì)菌，原生動(dòng)物和藻類和高等植物中，是植物合成蒎烯化合物的關(guān)鍵途徑。目前主要是利用原核生物大腸桿菌（Escherichia coli）和真核生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為底盤生物通過一系列代謝改造進(jìn)行蒎烯的生產(chǎn)。MEP途徑如下：

圖1 蒎烯合成甲基赤蘚糖醇-4-磷酸酯途徑Fig.1 Methylerythritol-4-phosphate pathway of pinene synthesis

2.1 大腸桿菌代謝工程合成蒎烯

大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)室常用的模式菌株，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）具有清晰的遺傳背景；（2）作為成熟的基因克隆表達(dá)菌株便于操作；（3）繁殖迅速，培養(yǎng)代謝易于控制。所以大腸桿菌可以作為微生物代謝產(chǎn)蒎烯的首選菌株。在大腸桿菌中蒎烯的代謝合成是通過MEP途徑進(jìn)行，首先合成IPP和DMAPP前體，再通過各種萜烯合酶催化合成蒎烯（圖3）。在MEP合成蒎烯途徑中，葡萄糖通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為甘油醛-3-磷酸（glyceraldehyde 3-phosphate，G-3-P）和丙酮酸，5-磷酸脫氧木酮糖合酶（deoxyoxylulose-5-phosphate synthase，DXS）將3-磷酸甘油醛和丙酮酸縮合為5-磷酸脫氧木酮糖（deoxyoxylulose-5-phosphate，DXP），并利用自身的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）在DXP還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose5-phosphate reductoisomerase，DXR）作用下生成MEP。在MEP代謝通路中，MEP的生成被視為關(guān)鍵前體物質(zhì)，所以DXP和DXS代謝反應(yīng)被稱為關(guān)鍵限速反應(yīng)。MEP在2-甲基赤蘚醇磷酸胞苷酰基轉(zhuǎn)移酶（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase，IspD）作用下生成4-二磷酸胞苷酰-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇（4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol，CDP-ME），進(jìn)而經(jīng)過CDPME激酶（4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritolkinase，IspE）、2-C-甲基赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶（2-c-methylerythritol 2,4-cyclic diphosphate synthase，IspF）、4-羥基-3-甲基-2-丁烯焦磷酸（4-hydroxy-3-methyl-2-butene pyrophos phoric acid，HMBPP）合成酶（4-hydroxy-3-methyl-2-butene pyrophosphate synthase，IspG）和HMBPP還原酶（4-hydroxy-3-methyl-2-butene pyrophosphate reductase，IspH）的催化作用生成合成蒎烯的前體物質(zhì)牻牛兒基焦磷酸（GPP），GPP在PS的催化作用下生成蒎烯。

蒎烯合酶基因主要來(lái)源于松柏杉屬植物，YANG J M等[23]將來(lái)源于巨冷杉（Abiesgrandis）的蒎烯合酶基因?qū)氪竽c桿菌，并利用構(gòu)建的外源MVA途徑進(jìn)行蒎烯合成，搖瓶發(fā)酵最大產(chǎn)量達(dá)5.44 mg/L；SARRIA S等[24]將來(lái)源于火炬松（Pinus taeda）、歐洲云杉（Piceaabies）、巨冷杉（Abiesgrandis）的不同蒎烯合酶基因和牻牛兒基焦磷酸合酶基因進(jìn)行兩兩組合共表達(dá)和融合表達(dá)，優(yōu)化培養(yǎng)條件后蒎烯產(chǎn)量達(dá)32 mg/L；TASHIRO M等[25]通過實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化手段蒎烯合酶，并將其與GPP合酶基因以及MVA代謝途徑相關(guān)基因共同導(dǎo)入大腸桿菌中共表達(dá)，獲得蒎烯產(chǎn)量可達(dá)140 mg/L。

2.2 釀酒酵母代謝工程合成蒎烯

釀酒酵母與大腸桿菌相比具有更強(qiáng)大的蛋白表達(dá)和翻譯后修飾系統(tǒng)以及完整的內(nèi)膜系統(tǒng)，所以更適合蛋白的表達(dá)[26]，是蒎烯合成的優(yōu)秀底盤生物。在釀酒酵母中蒎烯的合成主要是通過MVA途徑進(jìn)行。首先釀酒酵母通過兩條代謝途徑產(chǎn)生乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）：（1）葡萄糖通過糖酵解途徑產(chǎn)生的丙酮酸進(jìn)入線粒體，在丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）復(fù)合體作用下產(chǎn)生乙酰輔酶A[27]；（2）存在胞質(zhì)中的丙酮酸在丙酮酸脫羧酶、乙醛脫氫酶和乙酰輔酶A合酶等一系列酶的催化作用下產(chǎn)生乙酰輔酶A[28-29]，乙酰輔酶A是釀酒酵母代謝網(wǎng)絡(luò)中最重要的代謝中間體，也是萜類物質(zhì)生成的重要前提物質(zhì)。乙酰輔酶A在硫解酶（thiolase，THL）和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A synthase，HMGS）的催化作用下生成HMG-CoA，HMG-CoA還原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）是MVA途徑中的關(guān)鍵限速酶，且此步催化反應(yīng)是一個(gè)不可逆的反應(yīng)。MVA在MVA激酶（mevalonate kinase，MK）磷酸化作用下生成甲羥戊酸-5-磷酸（mevalonate 5-phosphate，MVA-5-P），進(jìn)而在MVA-5-P-激酶（mevalonate 5-phosphate kinase，PMK）、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（diphosphate mevalonate decarboxylase，DPMD）等酶作用下生成IPP和DMAPP。與MEP途徑相同，利用牻牛兒基焦磷酸合酶（geranyl pyrophosphate synthase，GPPS）合酶和PS產(chǎn)生蒎烯。

以釀酒酵母作為底盤生物來(lái)生產(chǎn)蒎烯，目前報(bào)道的文章較少，陳天華等[30]通過在釀酒酵母中異源表達(dá)來(lái)源于火炬松（Pinus taedaL.）的蒎烯合酶基因，并通過對(duì)代謝途徑進(jìn)行一系列的優(yōu)化使蒎烯產(chǎn)量從初始的0.329 mg/L提高到最終的11.7 mg/L，這也是目前報(bào)道的在釀酒酵母中的最高產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)室以自主產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）作為底盤生物，經(jīng)過密碼子優(yōu)化將來(lái)源于火炬松（Pinus taeda）的蒎烯合酶基因整合到基因組中，通過搖瓶發(fā)酵其蒎烯產(chǎn)量達(dá)0.8 mg/L。對(duì)Candida glycerinogenes進(jìn)行了蒎烯的耐受性實(shí)驗(yàn)，該菌在1 g/L的酵母中仍然可以生長(zhǎng)，所以可以通過對(duì)代謝途徑進(jìn)行改造在Candida glycerinogenes進(jìn)行蒎烯生產(chǎn)有巨大潛力。MVA途徑如下：

圖2 蒎烯合成甲羥戊酸途徑Fig.2 Synthesis pathway of mevalonate from pinene

3 提高蒎烯合成的策略

近年來(lái)隨著合成生物學(xué)和代謝工程的發(fā)展，利用微生物合成高附加值產(chǎn)物已經(jīng)成為社會(huì)發(fā)展的趨勢(shì)。但是僅僅通過微生物自身的代謝途徑進(jìn)行代謝產(chǎn)物合成還是存在很大的局限性，所以為了進(jìn)一步提高代謝產(chǎn)物合成，一般有傳統(tǒng)方法、關(guān)鍵酶蛋白工程改造、高通量篩選高酶活蒎烯合酶（圖3）。

圖3 提高蒎烯合成的策略Fig.3 Strategies to enhance pinene synthesis

3.1 傳統(tǒng)方法

因?yàn)檩逑┑暮铣芍饕蒑VA途徑和MEP途徑[31-33]，所以為了提高蒎烯的產(chǎn)量，通常最直接的辦法是通過強(qiáng)化代謝通路中關(guān)鍵限速酶的表達(dá)來(lái)提高代謝通路碳流。研究表明HMGR是關(guān)鍵限速酶[34]，過表達(dá)基因HMGR可以明顯提高胞內(nèi)甲羥戊酸含量，增強(qiáng)MVA途徑的通量，除了HMGR是關(guān)鍵酶外，異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI1）催化IPP和DMAPP之間的異構(gòu)化，也是實(shí)現(xiàn)GPP合成的重要步驟[35]，通常情況下IPP和DMAPP之間含量差異巨大，通過過表達(dá)IDI1可以改變胞內(nèi)IPP和DMAPP的比例從而加速GPP合成。陳天華等[30]通過過表達(dá)截短的HMGR及IDI1等策略使蒎烯產(chǎn)量提高了34.5倍，所以強(qiáng)化代謝通路可以有效提高蒎烯產(chǎn)量。除了過表達(dá)關(guān)鍵限速酶外，通過引入外源基因，并進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)也是提高蒎烯產(chǎn)量的重要措施。

3.2 關(guān)鍵酶蛋白工程改造

MVA途徑或MEP途徑的關(guān)鍵酶的增強(qiáng)是提高蒎烯產(chǎn)量的傳統(tǒng)通用方法。雖然可以在一定程度上提高蒎烯產(chǎn)量，但是增加的大部分代謝碳流向了FPP和下游產(chǎn)物，只有很少部分GPP用于蒎烯的合成[36]。為了進(jìn)一步提高蒎烯產(chǎn)量需要引入特異性GPP合成酶并通過蛋白質(zhì)工程改造來(lái)提高酶的催化活性。由于有報(bào)道稱釀酒酵母中GPP和FPP的合成是由同一種酶-法呢基焦磷酸合成酶ERG20連續(xù)催化進(jìn)行的，所以對(duì)ERG20進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造，有望成為提高GPP合成的主要策略[37-39]，IGNEA C等[40]通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模分析了ERG20主要是F96、A99、N127抑制FPP合酶活性，然后對(duì)其進(jìn)行一系列突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別表達(dá)突變的ERG20（F96W）、ERG20（N127W）后，檜萜的產(chǎn)量分別提高了3.21和5.57倍。而F96W和N127W雙點(diǎn)突變使檜萜產(chǎn)量增加至10.32倍。陳天華等[30]通過在釀酒酵母中引入ERG20突變體ERG20ww（F96W/N127W），明顯提高了蒎烯產(chǎn)量，進(jìn)一步證明了對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行改造對(duì)提高蒎烯產(chǎn)量的重要性。

3.3 高通量篩選高酶活蒎烯合酶

除了強(qiáng)化代謝通路及改造關(guān)鍵酶的方法，最重要的是提高蒎烯合酶的酶活，通常采用的方法是紫外誘變、常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變及易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等來(lái)獲得突變文庫(kù)，但是如何獲得高酶活的蒎烯合酶，是后期篩選存在的關(guān)鍵問題[41]。隨著高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，可以為篩選高酶活蒎烯合酶提供思路。在所有的高通量篩選方法中，最受歡迎的是基于顏色或熒光的高通量篩選技術(shù)[42-43]?；陬伾驘晒獾募?xì)胞篩分是一種非常直觀的高通量篩選方法，一般用于生產(chǎn)來(lái)自有色產(chǎn)品（番茄紅素[44]、胡蘿卜素[45]、蝦青素[46]等）可以通過顏色深淺來(lái)檢查。隨著熒光激活細(xì)胞分選（fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）的發(fā)展[47-48]，可以將具有熒光代謝物或可被熒光染色的物質(zhì)的細(xì)胞調(diào)諧到特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，激活細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)，根據(jù)熒光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選單細(xì)胞水平的強(qiáng)度，大大提高了篩選效率[49]；TASHIRO M等[50]通過實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化，根據(jù)顏色差異成功篩選到了高酶活的突變蒎烯合酶，在搖瓶中蒎烯產(chǎn)量可以達(dá)到140 mg/L。

4 蒎烯毒性對(duì)蒎烯合成的影響

4.1 蒎烯毒性的脅迫機(jī)制

蒎烯作為一種單萜，對(duì)微生物細(xì)胞具有很強(qiáng)的毒副作用，因此常被用作抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的阻滯劑。它對(duì)微生物細(xì)胞的脅迫機(jī)制較為復(fù)雜細(xì)胞。目前的研究表明，單萜對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，其調(diào)控機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面：（a）破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致菌體死亡，LIU J D等[51]用致死劑量的檸檬烯脅迫釀酒酵母細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜流動(dòng)性降低、通透性增高且脂肪酸的比例增加，細(xì)胞膜功能受到了嚴(yán)重的損傷。（b）破壞細(xì)胞壁的完整性，抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。BRENNAN T C R等[52]研究表明，檸檬烯刺激引起了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)損傷，與細(xì)胞壁完整性通路有關(guān)的基因（ROM1，RLM1，PIR3，CTT1，YGP1，MLP1，PST1和CWP1）出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，且對(duì)細(xì)胞壁降解酶的敏感性增加了4倍，但目前對(duì)于單萜破壞細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的具體機(jī)理研究仍然不清楚。（c）刺激細(xì)胞導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量積累，破壞包括細(xì)胞膜在內(nèi)的多種細(xì)胞器膜的功能。BAKKALI F等[53]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母中不同的單萜處理可誘導(dǎo)不同類型ROS的積累；LIU J等[54]研究發(fā)現(xiàn)，隨著單萜處理濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外ROS水平增加，細(xì)胞內(nèi)MDA水平增加，萜處理后，胞內(nèi)主要抗氧酶的編碼基因如GSH2、TRR1和GPX2在轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)了12.8、6.0及32.2倍，表明釀酒酵母激活了其酶系抗氧化系統(tǒng)用以抵御ROS積累造成的氧脅迫。（d）影響胞內(nèi)能量代謝，URIBE S等[55]研究發(fā)現(xiàn)，β-蒎烯可以抑制細(xì)胞呼吸，影響酵母細(xì)胞中H+和K+的轉(zhuǎn)運(yùn)，并干擾線粒體膜的完整性和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的產(chǎn)生。

4.2 提高宿主蒎烯耐受性的策略

由以上單萜對(duì)細(xì)胞毒性的機(jī)制可以看出，當(dāng)單萜濃度達(dá)到一定值時(shí)，可能會(huì)造成不可逆的細(xì)胞損傷，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致細(xì)菌死亡[56-58]。目前的研究主要通過兩種方法降低蒎烯對(duì)細(xì)胞的毒性作用：一是提高細(xì)胞對(duì)蒎烯的耐受性。BRENNAN T C R等[52]通過逐步提高檸檬烯的脅迫濃度對(duì)釀酒酵母進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，經(jīng)過200次傳代培養(yǎng)篩選獲得6株檸檬烯耐受性明顯提高的菌株，通過基因組全測(cè)序鑒定獲得了關(guān)鍵突變蛋白tTcb3p1-989，并發(fā)現(xiàn)過表達(dá)tTcb3p1-989能夠使進(jìn)化前的菌株對(duì)檸檬烯的耐受性提高9倍。二是減少蒎烯與細(xì)胞的接觸，主要包括蒎烯的隔離和外排兩種方式。蒎烯主要是通過自由擴(kuò)散或者相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過主動(dòng)運(yùn)輸實(shí)現(xiàn)從胞內(nèi)到胞外的外排。DUNLOP M J等[59]將細(xì)菌基因組中篩選的43個(gè)外排泵在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)來(lái)源于大腸桿菌外排泵AcrAB和來(lái)源于泊庫(kù)島食烷菌（Alcanivorax borkumensis）的未鑒定的外排泵可以使大腸桿菌對(duì)檸檬烯的耐受性增加；WANG Y等[60]在釀酒酵母中異源表達(dá)了來(lái)自花香子囊的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GcABC-G1，顯著提高了重組酵母菌株的存活率。

雖然一些研究在不同程度上提高了細(xì)胞對(duì)單萜的耐受性，但總的來(lái)說(shuō)，單萜的毒性仍然是限制其高產(chǎn)的重要因素。但是，目前酵母對(duì)單萜的研究比較單一，僅限于檸檬烯，不夠全面，還沒有發(fā)現(xiàn)酵母對(duì)蒎烯的耐受性的研究。因此，分析蒎烯致毒性的主要機(jī)制并進(jìn)一步提高酵母耐受性，可以為通過代謝工程和合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建高效的酵母單萜合成平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。蒎烯脅迫機(jī)制如下：

圖4 蒎烯脅迫機(jī)制Fig.4 Mechanism of pinene stress

5 蒎烯生物合成的現(xiàn)狀及問題

利用代謝工程及合成生物學(xué)等方法在微生物中重構(gòu)蒎烯合成途徑，通過優(yōu)化合成途徑使微生物成為高效合蒎烯化合物的細(xì)胞工廠，已有不少文獻(xiàn)報(bào)道[61-63]。然而單萜的微生物合成發(fā)展仍然相對(duì)滯后，其產(chǎn)量?jī)H僅維持在毫克級(jí)別。目前蒎烯的合成主要是在大腸桿菌和釀酒酵母中通過MEP途徑和MVA途徑進(jìn)行合成。但是無(wú)論是MEP途徑還是MVA途徑都存在GPP前體供給不足的問題，由于GPP是蒎烯合成的直接前體物質(zhì)，所以GPP的供給量直接決定了蒎烯的產(chǎn)量。在釀酒酵母中缺乏GPP合成的特異性酶，GPP和FPP的合成由同一個(gè)酶ERG20連續(xù)催化[64]，且FPP的合成會(huì)消耗大量的前體GPP，這就造成了GPP不能在胞內(nèi)大量積累，但是又不能阻斷FPP的生成，因?yàn)镕PP的缺失對(duì)酵母是致死的[65-66]。所以通常的策略是對(duì)ERG20進(jìn)行F96W和N127W位氨基酸進(jìn)行突變ERG20WW以減弱向FPP合成的碳通量，而且不會(huì)影響GPP的合成。IGNEA C等[40]研究報(bào)道，在酵母底盤中表達(dá)ERG20ww時(shí)檜烯的產(chǎn)量較不引入該蛋白增加了10.5倍。除了增加前體物質(zhì)GPP的含量，對(duì)關(guān)鍵限速酶基因進(jìn)行突變或截短也是很重要的策略。在MVA途徑中，HMGR是關(guān)鍵限速酶，HMGR又分為HMG1與HMG2[67]，這兩種酶N末端均有將蛋白質(zhì)靶向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)，C末端具有催化活性結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)N端結(jié)構(gòu)進(jìn)行截短，使C端活性中心暴露在胞質(zhì)可以增大HMGR的催化活性。KEASLING J D等[68]在釀酒酵母中過表達(dá)截短的tHMGR將紫穗槐二烯的產(chǎn)量提高了將約5倍。所以若要提高蒎烯的產(chǎn)量，需要解決的關(guān)鍵問題就是優(yōu)化其代謝途徑，解除限速酶對(duì)代謝通路的限制并提高關(guān)鍵前體物質(zhì)的積累量。

6 總結(jié)和展望

本文主要綜述了蒎烯的微生物合成途徑以及利用大腸桿菌和釀酒酵母作為底盤生物生產(chǎn)蒎烯。通過對(duì)蒎烯合成途徑進(jìn)行解析，旨在尋找和發(fā)現(xiàn)最優(yōu)的蒎烯合成通路。目前蒎烯的微生物合成幾乎陷入瓶頸階段，其關(guān)鍵問題在于蒎烯合成前體物質(zhì)GPP的缺乏，以及代謝途徑中關(guān)鍵限速酶HMGR對(duì)通路碳流的限制作用。但是，這并不表明蒎烯微生物合成沒有前景，相反只要突破目前面對(duì)的瓶頸問題，通過微生物來(lái)產(chǎn)蒎烯將會(huì)有巨大發(fā)展前景。為了提高微生物的蒎烯合成能力，具體策略如下：1）蒎烯合成途徑中關(guān)鍵酶（ERG20、HMGR、IDI1）的篩選和改造；2）定向進(jìn)化策略，對(duì)蒎烯合酶基因進(jìn)行定向進(jìn)化，提高催化活性；3）引入高效的異源代謝途徑來(lái)增加前體物質(zhì)的積累量。4）弱化支路途徑和GPP下游途徑對(duì)碳流的消耗，保證GPP碳源的供應(yīng)；5）提高底盤生物對(duì)蒎烯的耐受性。值得思考的是，除了對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行過表達(dá)、敲除以及突變，還需要注意代謝途徑中的非關(guān)鍵基因，因?yàn)殛P(guān)鍵基因的敲除和替換對(duì)菌體可能是致命的，所以需要考慮如何從全局角度設(shè)計(jì)更為合理的代謝工程方案。